【摘 要】
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本实验室从嗜铁钩端螺旋菌UBK03中克隆到一个与镍抗性相关的操纵子ncrABCY,该操纵子含4个结构基因ncrA,ncrB,ncrC及ncrY。NcrA为该抗性系统的核心组件,与辅助蛋白NcrC组装成跨膜通道,NcrY对抗镍系统起负作用,NcrB作为阻遏蛋白能够调节ncrA基因的表达。本论文研究是以此操纵子为对象,开展了其表达调控机理的研究。将ncrABCY转入大肠杆菌JM109得到克隆子NR21
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本实验室从嗜铁钩端螺旋菌UBK03中克隆到一个与镍抗性相关的操纵子ncrABCY,该操纵子含4个结构基因ncrA,ncrB,ncrC及ncrY。NcrA为该抗性系统的核心组件,与辅助蛋白NcrC组装成跨膜通道,NcrY对抗镍系统起负作用,NcrB作为阻遏蛋白能够调节ncrA基因的表达。本论文研究是以此操纵子为对象,开展了其表达调控机理的研究。将ncrABCY转入大肠杆菌JM109得到克隆子NR21。通过比较未经Ni2+诱导及经过诱导的NR21菌株在含Ni2+ LB培养基中的生长情况,发现未经诱导的NR21菌株生长比经过诱导的NR21菌株要滞后2小时,说明ncrABCY受Ni2+诱导表达。RT-PCR实验对基因转录分析,发现Ni2+能够增强ncrA,ncrB,ncrC的转录水平,荧光定量PCR结果显示在含Ni2+ LB培养基中生长的NR21菌株ncrA的转录量要比在普通LB培养基中高10倍。利用S1 mapping实验确定了ncrA基因的转录起始位点。对ncrA启动子pncrA序列分析,在转录起始位点上发现了一段富含GC的反向重复序列p1p17,并且通过凝胶阻滞实验和DNase I足迹实验,确定NcrB蛋白能够与pncrA上的反向重复序列p1p17特异结合。细菌单杂交实验进一步在菌株体内检测了NcrB与pncrA的相互结合作用。并且还发现,在细菌单杂交正筛选培养基中加入1mM Ni2+,NcrB与pncrB的结合作用能够被解除。由此可知,NcrB是一个受镍调控的金属调节蛋白。此外通过构建一系列pncrA截短片段,发现只有完全包含p1p17的截短片段才能够与NcrB结合。这也说明NcrB能通过反向重复序列直接结合在pncrA上。在不结合Ni2+时,NcrB通过与p1p17结合,阻止RNA聚合酶与启动子的结合,抑制了ncrA的表达。在ncrABCY操纵子上的另外两个启动子pncrB和pncrY中都包含了与p1p17相似但不完整的反向重复序列,体内实验表明它们都不能与NcrB结合。通过对这些序列比较,确定p1p17反向重复序列之间的5个碱基长度对结合作用是必须的。通过将该位置的5个碱基替换成任意残基构建随机文库,运用细菌单杂交系统筛选其中能与NcrB相互作用的片段,得出这5个碱基中第4位的碱基为保守碱基。由此可以确定NcrB在pncrA序列中特异识别的序列。
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