论文部分内容阅读
在生物柴油制备方法中微生物脂肪酶催化的生物柴油制备方法是最为绿色环保的，但游离脂肪酶稳定性差、回收困难及其固定化成本高等使得生物柴油生产成本偏高。因此，新型生物催化剂—表面展示脂肪酶的全细胞成为近来关注热点。本文对实验室已成功构建的表面共展示有具协同催化效应的南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)与疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶(TLL)的毕赤酵母工程菌进行高密度发酵，获得较大批量的酵母全细胞催化剂，然后在适宜保护剂作用下冷冻干燥获得具有较好催化性能且便于储藏的冻干全细胞，并以制备得的表面共展示有CALB与TLL脂肪酶的冻干全细胞作为催化剂催化制备生物柴油。主要研究内容及结果如下： （1）研究了全细胞催化剂的批量制备。在测序验证工程菌构建正确后，采用高密度发酵获得较大批量的菌体细胞，测定了工程菌生长曲线，发现28℃，200rpm恒温培养时其对数生长期出现在20-40h期间。3L发酵罐高密度发酵，诱导106h(即发酵142h)时，细胞水解活力达最高，1,700U/g干细胞，细胞密度也最大，其OD600=378.35，此时为较优发酵终止时间。 （2）优化了全细胞催化剂冷冻干燥条件。冷冻干燥并添加适宜保护物质制备具有较优催化活性及储藏稳定性的全细胞催化剂。用不同pH的磷酸盐缓冲液及含不同保护物质的溶液处理收集到的菌体细胞，冷冻干燥制备全细胞干粉。测定制备的全细胞干粉对大豆油与甲醇的转酯化活力，发现 pH7.5的磷酸盐缓冲液及海藻糖和PEG20000处理的全细胞催化活力较高，且海藻糖处理后的冻干全细胞储藏稳定性更佳，4℃密封储存3个月后仍保留近80％的催化活力。对保护物质的保护机理做了初步探究。SEM检测表明海藻糖和PEG20000保护下的冻干细胞有层状交联且层与层之间有疏松孔结构，初步推测这些特殊结构可能与其保护作用相关。 （3）对冻干全细胞催化剂进行了酶学性质研究。发现冻干全细胞具有较好的温度耐受性及较广泛的底物适应性。豆油介质中65℃处理1h后残留转酯酶活在60％以上，但更适宜较低温度下的催化反应。以豆油为参照，在所选的其他几种油料中除乌桕梓油外底物甲酯化率均达到豆油的75％以上。有机溶剂对全细胞催化剂催化活力的影响较显著。实验选取的7种有机溶剂对全细胞催化剂毒害较大的是甲醇，经其处理3h后，全细胞催化活力仅存16％，而经叔丁醇、异辛烷、正庚烷、正己烷等疏水性较强的有机溶剂处理全细胞酶活保留达80％以上。 （4）应用全细胞催化剂催化合成生物柴油，并优化了反应条件。通过溶剂工程确定20％叔丁醇添加体系为较优反应体系；通过单因素及正交实验确定该体系中全细胞催化制备生物柴油的最优条件为：醇油摩尔比4:1，反应温度35℃，全细胞添加量0.7g，水添加量4％(w/w，油重)，反应时间36h。在此条件下，生物柴油得率可达86.25％。