【摘 要】
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由Xanthomonas campestris pv.campestris（Xcc）引起的十字花科作物黑腐病是世界范围内重要的作物病害。前期研究表明该病原菌的Ⅲ型分泌系统对其毒性和致病性具有关键的作用。但是,对该病原菌的单个Ⅲ型效应因子的毒性功能及其参与致病的作用机理的了解还很缺乏。本研究通过转基因技术以及生物化学的方法,研究了Xcc Ⅲ型效应因子AvrXccB抑制植物免疫的能力及其潜在的作用机理
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由Xanthomonas campestris pv.campestris（Xcc）引起的十字花科作物黑腐病是世界范围内重要的作物病害。前期研究表明该病原菌的Ⅲ型分泌系统对其毒性和致病性具有关键的作用。但是,对该病原菌的单个Ⅲ型效应因子的毒性功能及其参与致病的作用机理的了解还很缺乏。本研究通过转基因技术以及生物化学的方法,研究了Xcc Ⅲ型效应因子AvrXccB抑制植物免疫的能力及其潜在的作用机理。具体结果如下:首先,通过分泌实验验证了 AvrXccB是依靠Ⅲ型分泌系统泌出的效应因子。根据AvrXccB氨基酸序列分析结果推测该蛋白N端第2位氨基酸Gly可能被豆蔻酰化。利用荧光显微镜对转基因拟南芥中表达的AvrXccB-GFP或者AvrXccBG2A-GFP进行定位分析,发现AvrXccB-GFP定位于植物的细胞膜而AvrXccBG2A-GFP则分散在细胞质中。表明其膜定位依靠于该蛋白N端保守的假定豆蔻酰化位点。其次,通过系列实验确定了 AvrXccB在抑制植物免疫反应中的功能。第一,利用原生质体瞬时表达体系检测了 AvrXccB对flg22触发的免疫反应的抑制作用,发现AvrXccB能强烈地抑制flg22诱导的由NHO1启动子驱动的荧光素酶表达。然而,假定豆蔻酰化位点突变AvrXccBG2A以及催化三联体活性中心位点突变AvrXccBH182A和AvrXccBC239A都不同程度地减弱了该蛋白对flg22诱导的NHO1-荧光素酶表达的抑制作用。第二,我们构建了地塞米松诱导表达AvrXccB、AvrXccBG2A、AvrXccBH182A和AvrXccBC239A的转基因拟南芥株系。在转基因株系中,诱导表达的AvrXccB可以抑制flg22触发的胼胝质的沉淀和活性氧的产生。第三,通过Xcc和假单胞菌马铃薯致病变种（Peudomomassyringae pv.tomato DC3000）的接菌实验,发现这些病原菌在转基因拟南芥体内的生长量比在野生型的植株中显著升高,表明该效应因子在植物体内发挥重要的毒性功能。而AvrXccBG2A、AvrXccBH182A和AvrXccBC239A等点突变蛋白都部分或全部丧失了对植物免疫的抑制作用,说明AvrXccB的膜定位和催化活性中心对其毒性功能起关键作用。最后,为了探究AvrXccB的作用机理,通过酵母双杂交的方法筛选到与AvrXccB互作的候选蛋白,S-腺苷-L-甲硫氨酸依赖的甲基转移酶（S-adenosyl-L-methionine-dependent methyltransferase）SAM-MT1。随后,通过pull-down和免疫共沉淀技术验证了 AvrXccB与SAM-MT1的互作。另外,发现SAM-MT1的同源蛋白SAM-MT2也与AvrXccB在体内互作,SAM-MT1与SAM-MT2在体内互作,并且SAM-MT1也可以发生自身互作。在本生烟中的亚细胞定位显示SAM-MT1位于与膜相关、间断的点状结构中,部分定位于植物的细胞膜上,也存在于细胞质中。研究还发现SAM-MT1受微生物相关的分子模式flg22和elf18诱导表达;同时,在接菌DC3000后,SAM-MT1在植物中被快速而适度地诱导表达;而SAM-MT2在接菌DC3000 48小时后表达量急剧升高。这说明SAM-MT1和SAM-MT2可能在植物免疫中起作用。综上,研究发现Xcc效应因子AvrXccB可能通过作用于SAM-MT1和SAM-MT2的复合物来抑制植物的免疫反应。这些结果为深入阐释AvrXccB发挥毒性功能的机理提供了有力的线索。
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