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鸡新城疫(Newcastle Disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle Disease Virus，NDV)引起的一种以呼吸道、消化道粘膜出血为特征的高度接触性、急性败血性禽类传染病，被世界动物卫生组织列为危害养禽业的法定报告动物传染病。 NDV对宿主的感染、致病很大程度上是病毒因素和宿主因素相互作用的结果。近年来研究显示NDV感染宿主范围不断扩大，不同来源的病毒毒力呈现明显增强的趋势，但不同来源NDV对宿主感染的致病机制差异尚不清楚，值得进一步探讨。基于此，本研究根据NDV不同的生物学特性，筛选出鸡源NDV-GM和鸭源NDV-YC2株做为研究毒株，建立了NDV感染鸡胚成纤维细胞模型；在此基础上，应用基于Solexa/Illumina系统的数字化表达谱(DGE)测序方法，从mRNA水平研究鸡源、鸭源NDV感染宿主细胞后基因表达谱变化；应用iTRAQ方法从蛋白质水平研究鸡源、鸭源NDV感染宿主细胞后病毒编码蛋白与宿主细胞蛋白表达的变化。 本研究的主要内容如下： 1.鸡源NDV-GM株和鸭源NDV-YC株生物学特性研究 对2株病毒的F基因和HN基因进行分析，结果显示2株病毒F基因全长均为1792 bp，预计编码553个氨基酸，均含有保守的6个潜在糖基化位点(分别位于85、191、366、447、471、541残基处)；GM株F蛋白裂解位点的序列为RRQKRF，YC株F蛋白裂解位点序列为RRQRRF，均符合NDV强毒株的分子特征。F基因系统进化树显示，GM属于基因Ⅶ型，YC株属于基因Ⅸ型，在进化树中处于不同的进化分支。GM株和YC株的HN蛋白均为571个氨基酸，均含有5个相对保守的潜在糖基化位点。对2株病毒NDV-GM株和NDV-YC株进行MDT、ICPI、IVPI、ELD50、TCID50进行了测定，NDV-GM株分别为70.4 h、1.78、2.68、108.5/0.2 mL、108.4/0.1 mL，NDV-YC株分别为58.5 h、1.93、1.77、108.5/0.2 mL、109.25/0.1 mL，检测结果表明2株毒株均为强毒株。鸡胚成纤维细胞致病性结果显示鸡源NDV-GM株最早于22 h检测到HA阳性，先于鸭源NDV-YC株2个小时，2株病毒接种后70 h左右HA均达到峰值，其中NDV-GM株HA峰值为5log2，低于NDV-YC株6log2。我们将NDV-GM株和NDV-YC株病毒通过滴鼻、点眼分别感染4周龄SPF鸡及15日龄非免疫番鸭和三水白鸭，结果2株病毒感染后5天内4周龄SPF鸡均全部死亡，死亡率均为100％；感染15日龄非免疫三水白鸭后没有出现明显发病症状；感染番鸭后NDV－GM感染组第6天开始出现死亡，NDV－YC感染组有轻微的发病症状，没有出现死亡病例，2株病毒对番鸭的致病性差异显著。 2.鸡源NDV-GM和鸭源NDV－YC感染DF－1细胞后的数字化表达谱分析 为研究鸡源NDV－GM和鸭源NDV－YC感染DF－1细胞的数字化表达谱，本实验以100 TCID50病毒剂量浓度感染DF－1细胞，24 h时收获细胞并提取细胞总RNA，利用Illumina的Genome Analyzer的平台测序。分析显示，与空白对照相比，鸡源NDV-GM检测到的差异Tag数达23万，去除病毒基因后与鸡基因组对应的差异基因达1.9万个；鸭源NDV-YC检测到的差异Tag数达26万，去除病毒基因后与鸡基因组对应的差异基因达1.9万个。将测序得到的Tag对应到参考基因库，统计注释并进行GO(Gene Ontology)鉴定，结果显示NDV-GM和NDV-YC感染组两组和空白比对后共测得所处的细胞位置的基因9913个，分子功能的基因9800个，参与的生物过程的基因9290个；其中NDV-GM感染组中注释到GO功能的基因情况如下：所处细胞位置的包括细胞成分(96.3％)、细胞内细胞器(60.7％)、细胞膜(30.3％)等，分子功能包括催化活性(41.3％)、蛋白结合(30.2％)、核苷酸结合(16.1％)等，参与的生物过程包括生物调节(44.1％)、细胞代谢过程(43.4％)、免疫系统进程(6.6％)；NDV-YC感染组GO分析相似。与空白组对照，差异基因分析显示NDV-GM有差异基因2435个，NDV-YC感染组有1922个差异基因。差异表达基因进行聚类分析，从NDV-GM和NDV-YC感染组两组和空白相比的基因调节交集中，有差异基因757个基因，2株NDV感染组发生调节的相同基因共同注释到ACTR3、HSP25、TXNDC10蛋白等。Pathway分析，发现基因参与多条信号通路，主要包括癌症的信号通路、激动蛋白细胞骨架的调节、TGF-beta等信号通路。 3.鸡源NDV-GM株和鸭源NDV-YC株感染细胞后蛋白质组学研究 为研究2株病毒感染细胞中蛋白的变化，本研究采用iTRAQ方法对鸡源NDV-GM和鸭源NDV-YC感染CEF细胞进行了蛋白质组学研究。鸡源NDV-GM和鸭源NDV-YC感染细胞、空白细胞三个样品平行上样共检测到1721个蛋白。相对于空白对照组，鸡源NDV-GM感染细胞后差异蛋白显著上调的有16个，显著下调的11个，鸭源NDV-YC感染细胞后差异蛋白显著上调的有15个，显著下调的13个。这些差异蛋白主要包括连接蛋白(54.42％)、细胞成分蛋白(24.64％)、分解代谢蛋白(13.13％)和应激蛋白(6.36％)等相关蛋白等。通过COG数据库进行比对，预测这些蛋白可能的功能并对其做功能分类统计，主要包括功能蛋白292个，蛋白质修饰、转运、蛋白分子伴侣190个，参与核糖体的合成、蛋白翻译的蛋白160个。Pathway显著性富集分析显示TGF信号通路TGFβ的受体TGFβRI上调，肿瘤细胞耐受TGFβ的生长抑制。应用Westernblot实验验证CathepsinD和β-actin两个蛋白，分析CathepsinD蛋白Westernblot验证结果与iTRAQ蛋白质组学鉴定结果一致。