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团头鲂（Megalobrama amblycephala）俗称武昌鱼(Wuchang bream)，属于鲤形目（Cypriniformes），鲤科（Cyprinidae），鲌亚科（Cultrinae），鲂属（Megalobrama），具有食性广、生长快、生产成本低、成活率高等优点，是仅存于我国的一种重要淡水经济鱼类。 MicroRNAs（miRNAs）是广泛存在于真核生物中的一类内源性的具有转录水平和转录后水平调控功能的非编码小RNA，几乎涉及目前已知的所有生物学过程，包括生长、发育、增殖分化、凋亡、肿瘤发生发展等。已有大量研究表明一些低氧调节miRNAs(hypoxia-regulated microRNAs，HRMs)参与低氧应答过程。目前关于鱼类低氧适应的miRNAs报道较少。本研究分析了硬骨鱼类特有的miRNA簇miR-462/731的序列特征及同源性，团头鲂miR-462/731的时空表达谱。此外，在体外构建一系列miR-462/731簇上游低氧相关HRE(hypoxia responseelement)位点的启动子重组载体，分析不同HRE位点在低氧条件下的转录活性，为进一步探究miRNAs在鱼类低氧调控中的作用机制奠定基础。 主要研究结果如下: 1.硬骨鱼类miR-462和miR-731成熟序列分析 本研究扩增出团头鲂miR-462/731成熟序列。与其他9种硬骨鱼的miR-462/731成熟序列以及人的miR-191/425序列进行多序列比对发现其种子序列的高度保守性。进化树分析表明，硬骨鱼类的miR-462和miR-731序列的保守性很高，且聚为两个不同的分支;对于miR-462序列，团头鲂与草鱼聚为一小支，再与其他鱼类聚为一大支;对于miR-731，团头鲂与草鱼、斑马鱼和鲤等鲤科鱼类聚为一个小支，这些结果说明草鱼与团头鲂的进化关系最近。 2.硬骨鱼类miR-462/731上游序列的生物信息学分析 本研究扩增出团头鲂miR-462/731上游启动子候选区域(-2500bp)，预测出3个HRE位点。与其他硬骨鱼类的miR-462/731上游序列的生物信息学分析表明，启动子中均包含多个预测的启动子序列，如TATA框，HRE，ISRE，PU.1等，表明miR-462/731上游调控序列具有高度保守性，提示可能参与重要的调控功能。另外，对miR-462/731的基因组位置的同线性分析发现，硬骨鱼的miR-462/731序列均位于impdh2（inosine monophosphate dehydrogenase2，肌苷5‘-单磷酸脱氢酶2）和dalrd3（DALR anticodon binding domain containing3）基因之间。 3.团头鲂miR-462/731的时空表达及低氧处理条件下的表达分析 本研究对团头鲂miR-462/731进行qRT-PCR时空表达分析发现，在胚胎发育的不同时期，这两个miRNAs均在神经胚期的表达量最高，而在胚胎发育早期，表达量较低，之后逐渐上升，推测miR-462/731在团头鲂的胚胎发育中晚期发挥重要功能。miR-462/731在鳃中表达量最高，而在血液、肝脏和性腺的表达量较低，说明其在鳃中参与重要的调控功能。在低氧条件下，miR-462/731在血液中均呈现上调表达，而在其他组织中的表达量均下降，推测在低氧条件下，血液中miR-462/731参与低氧应答调控。体外CoCl2模拟低氧处理MAF细胞分析团头鲂miR-462/731的表达水平发现，这两个miRNAs均是在100μM CoCl2处理后48h表达量达到最大值。 4.团头鲂miR-462/731启动子缺失体的构建和活性分析 对团头鲂miR-462/731上游预测到的3个HRE位点进行体外荧光素酶活性分析发现，与阴性对照PGL3-Basic质粒转染组相比，PGL3-1HRE，PGL3-2HRE，以及PGL3-3HRE质粒转染组的荧光素酶活性均明显升高，说明启动子缺失体PGL3-1HRE（-2105bp至-1765bp）可能包含正调控元件。用100μM CoCl2处理转染过重组载体的细胞发现，仅启动子缺失体PGL3-1HRE的活性显著增加，推测该HRE位点(CCACGTAT)可能是参与低氧应答的重要作用元件。 5.团头鲂miR-462/731对细胞增殖和细胞周期的影响 将miR-462和miR-731模拟物分别转染到团头鲂鳍条细胞中，检测其对细胞增殖和细胞周期的影响，结果显示，miR-462/731可抑制细胞增殖，且通过抑制细胞周期的G2期进而抑制细胞周期进程。