野桑蚕细胞色素P450基因的克隆、组织表达及其功能研究

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细胞色素P450单加氧酶系是一类广泛分布于生物有机体中的重要酶系,在生物体对外源化合物和内源化合物的代谢调节过程中起着非常重要的作用,很多证据表明,昆虫细胞色素P450酶系介导的代谢抗性是大多数昆虫产生抗性和对寄主植物适应性的主要机制。野桑蚕与家蚕有共同起源,长期被作为桑园害虫防治,野桑蚕对不良环境的是适应性以及对农药的抗性等方面比家蚕强。因此对野桑蚕抗药性的研究一方面可以为提高家蚕抗药性研究提供基础,另一方面也为鳞翅目害虫的防治提供理论依据。为研究野桑蚕对菊酯农药的抗性,我们就野桑蚕细胞色素P450展开研究,主要研究结果如下: 1野桑蚕中肠组织cDNA文库的构建以野桑蚕中肠组织为材料构建cDNA文库。经鉴定文库的滴度达6.2×105pfu/mL,文库插入片段的平均大小为1.2kb左右。通过构建野桑蚕中肠组织cDNA文库,为以后筛选新的细胞色素P450基因以及其它抗性相关基因提供材料。 2野桑蚕7个细胞色素P450基因的克隆和组织表达根据家蚕基因组预测细胞色素P450的序列设计7对引物,以5龄3d野桑蚕中肠cDNA为模板,克隆获得7条野桑蚕P450基因,其中1个属于CYP4家族,6个属于CYP6家族。分别命名为:CYP4M5、CYP6AU1、CYP6AB5,CYP6AE8、CYP6AE9、CYP6AE21和CYP6AE22。此外分析鉴定了这些基因在野桑蚕各组织中的mRNA表达水平以及氯氰菊酯(5ng)诱导后mRNA的表达水平,结果显示:这7个基因在各个组织中的表达量不一致,在中肠和脂肪体中表达量较高。氯氰菊酯诱导24小时后,CYP4M5在中肠和脂肪体中表达量分别升高了1.1倍和4.4倍;CYP6AE22在中肠和脂肪体中表达量分别升高了1.5倍和2.5倍。通过组织诱导实验,从克隆得到的7个P450基因中获得了两个诱导后表达上调的基因(CYP4M5和CYP6AE22),推测这两个基因与氯氰菊酯抗性相关,为进一步研究P450在野桑蚕对氯氰菊酯代谢中的作用打下基础。 3利用杆状病毒—昆虫细胞系统表达野桑蚕CYP6AE22酶本实验利用Bac-to-Bac杆状病毒表达载体系统,建立了CYP6AE22的BmNPV昆虫细胞表达体系,成功表达了CYP6AE22基因。该基因的表达为进一步构建体外代谢酶系,研究对外源物质的代谢,最终确定其功能打下基础。
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