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第一部分睾酮对3T3-L1脂肪细胞炎症因子产生的影响及筛查影响炎症因子生成的信号通路关键分子目的:多囊卵巢综合征（PCOS）患者普遍存在代谢性炎症,高雄激素血症是PCOS的主要生化特征,有临床研究表明高雄激素血症与代谢性炎症密切相关,但机制不明。脂肪细胞是机体产生炎症因子的重要部位之一。本部分拟通过离体实验研究睾酮对3T3—L1脂肪细胞炎症因子生成时间和浓度效应的影响,并筛查影响炎症因子生成的信号通路关键分子。方法:诱导成熟的3T3-L1脂肪细胞（1）在无脂多糖（LPS）刺激下（即基础状态下）,用10-9～10-5mol/L睾酮分别处理10’、30’、12h、24h、48h;以无睾酮组作空白对照。RT—PCR及ELISA法检测细胞白介素—6（IL—6）和单核细胞趋化蛋白—1（MCP—1）的mRNA和蛋白的表达;用免疫印迹检测炎症信号通路核因子—kB（NF—kB,p—65）、ERK1/2及p38—MAPK的磷酸化及表达。（2）在脂多糖（LPS）刺激下,即用10-9～10-5mol/L睾酮分别预处理12h、24h、48h后,再加入LPS处理6h;以单纯LPS处理6h组作为对照组。RT—PCR及ELISA法检测细胞白介素—6（IL—6）和单核细胞趋化蛋白—1（MCP—1）的mRNA和蛋白的表达;用免疫印迹检测炎症信号通路核因子—kB（NF—kB,p—65）、ERK1/2及p38—MAPK的磷酸化及表达。结果:（1）基础状态下,①与空白对照组相比,睾酮处理组细胞上清液IL—6、MCP—1的含量明显增高（p＜0.05）,其中以10-5mol/L处理24h时,细胞上清液中IL—6、MCP—1的含量较其他浓度处理组高（p＜0.05）;②与空白对照组相比,睾酮处理组处理12h时,细胞中IL—6、MCP—1mRNA的合成明显增加（P＜0.05）,其中以10-5mol·L-1睾酮和10-9mol·L-1睾酮处理组对细胞合成IL—6、MCP—1的mRNA的促进作用较其他组增强（P＜0.05）,而10-7mol·L-1睾酮处理组较其他浓度睾酮处理组作用减弱（p＜0.05）;③与空白对照组相比,睾酮处理组可在处理10-30min及12h时使NF-kB（p—65）及ERK1/2的磷酸化水平增加（P＜0.05）,但不能增加p38MAPK的磷酸化,其中以10-5mol·L-1睾酮处理组及10-9mol·L-1睾酮处理组促进p—65及ERK1/2磷酸化的作用强,而10-7mol·L-1睾酮处理组的作用较弱（均p＜0.05）。（2）在LPS刺激状态下,①与单纯用LPS刺激组比,10-5mol/L睾酮预处理组细胞上清液中IL—6、MCP—1的浓度均明显增加（p＜0.05）,其中预处理48h时,炎症因子IL—6、MCP—1的浓度较其他预处理组增加（p＜0.05）;10-9mol/L睾酮预处理组细胞上清液中IL-6、MCP-1的浓度与单用LPS组差异无统计学意义（p＞0.05）,而10-7M睾酮预处理组加入LPS后细胞上清液IL-6、MCP-1的含量较单用LPS处理组明显减少（p＜0.05）。②与单纯用LPS刺激组比,10-5M睾酮预处理12h组,细胞IL-6、MCP-1的mRNA水平明显增加（p＜0.05）,并可持续至24h;10-7M睾酮预处理组细胞IL-6、MCP-1的mRNA水平明显降低（p＜0.05）;10-9M睾酮预处理组细胞IL—6、MCP—1的mRNA水平未见明显变化（p＞0.05）。③与单纯用LPS刺激组比,睾酮预处理组处理10—30min及12h时也能增加NF—kB（p—65）及ERK1/2的磷酸化水平,但不能活化p38—MAPK,其中以10-5mol·L-1睾酮预处理组增加p—65及ERK1/2磷酸化的水平明显（p＜0.05）,而10-7mol·L-1睾酮处理组可减少p—65及ERK1/2的磷酸化水平（p＜0.05）。结论:1.睾酮能直接促进3T3—L1脂肪细胞炎症因子的表达及其分泌;且高浓度的睾酮与LPS促炎症因子生成的作用有叠加效应。2.在3T3—L1脂肪细胞中,基础状态下及LPS刺激状态下,睾酮均能活化下游信号通路分子NF—κB及ERK1/2,但对p38MAPK无活化作用。第二部分验证睾酮通过活化NF—kB、ERK1/2分子促进3T3-L1脂肪细胞炎症因子的生成目的:前一部分试验,我们已经发现睾酮可促进不同状态下3T3—L1脂肪细胞炎症因子的生成,并且发现睾酮能活化信号通路分子NF—κB及ERK1/2,我们在本部分实验中进一步验证雄激素是通过活化信号通路NF—κB、ERK1/2而促进3T3-L1脂肪细胞炎症因子的生成,即NF—κB、ERK1/2是雄激素信号通路与炎症信号通路的交叉对话分子。方法:诱导成熟3T3-L1前脂肪细胞（1）在基础状态下,分别加入NF—κB、ERK1/2的抑制剂预处理2h,再用10-5mol/L睾酮处理24h,ELISA法检测细胞上清液炎症因子IL—6、MCP—1的浓度;分别加入NF—κB、ERK1/2的抑制剂预处理2h,再用10-5mol/L睾酮处理12h,RT—PCR法检测细胞中炎症因子IL—6、MCP—1的mRNA表达,免疫印迹检测NF—κB、ERK1/2的磷酸化水平及表达,DNA凝胶阻滞实验检测NF—κBp65与DNA结合活力的改变。（2）LPS刺激状态下,分别加入NF—κB或ERK1/2的抑制剂预处理2h,用10-5mol/L睾酮预处理48h后再加入LPS处理6h,ELISA法检测细胞上清液炎症因子IL—6、MCP—1的浓度;分别加入NF—κB或ERK1/2的抑制剂预处理2h,用10-5mol/L睾酮预处理12h后再加入LPS处理6h,RT—PCR法检测细胞中炎症因子IL—6、MCP—1的mRNA表达。免疫印迹检测NF—κB、ERK1/2的磷酸化水平及表达,DNA凝胶阻滞实验检测NF—κBp65与DNA结合活力的改变。结果:（1）加入ERK1/2的抑制剂预处理后,在上述两种状态下,上清液中IL—6、MCP—1的浓度及其mRNA水平仅能部分抑制;而加入NF—κB的抑制剂后,能完全抑制IL—6、MCP—1的合成。结论:基础状态下及LPS刺激下,高浓度的睾酮能通过活化信号通路中ERK1/2/NF—κB而促进3T3—L1脂肪细胞炎症因子生成的合成及分泌。第三部分睾酮对3T3-L1脂肪细胞胰岛素敏感性影响的机制探讨目的:在离体水平探讨雄激素对3T3-L1脂肪细胞胰岛素信号通路影响的分子机制方法:将3T3-L1前脂肪细胞诱导成熟,在基础状态下,用10-5mol/L睾酮处理12h,免疫印迹检测细胞IRS—1的酪氨酸磷酸化水平及其总蛋白IRS—1、GLUT—4的表达,以及胰岛素刺激下膜蛋白GLUT—4的表达。在LPS刺激状态下,先用10-5mol/L睾酮分别预处理细胞12h,再继用脂多糖（LPS）刺激6h,免疫印迹检测细胞中IRS—1酪氨酸磷酸化水平和总蛋白IRS—1及GLUT—4的表达,以及胰岛素刺激下膜蛋白GLUT—4的表达。上述两种处理方法组,先加入NF—κB或ERK1/2的抑制剂预处理,再用免疫印迹检测细胞总蛋白中IRS—1的酪氨酸磷酸化水平及其总蛋白IRS—1、GLUT—4的表达,以及胰岛素刺激下膜蛋白GLUT—4的表达。结果:基础状态下,10-5mol/L睾酮处理12h与无睾酮组相比,细胞总蛋白IRS—1及GLUT—4的表达均增多（p＜0.05）,但使胰岛素刺激下的IRS—1的酪氨酸磷酸化水平及膜蛋白GLUT—4的表达减少（p＜0.05）,加入ERK1/2或NF—kB的抑制剂后,IRS—1的酪氨酸磷酸化水平及膜蛋白GLUT—4的表达仅能部分逆转。在LPS刺激状态下,10-5mol·l-1睾酮预处理12h后,细胞总蛋白IRS—1的表达增多（p＜0.05）,但细胞总蛋白GLUT—4的表达及胰岛素刺激下的IRS—1的酪氨酸磷酸化和膜蛋白GLUT—4的表达均减少（p＜0.05）,加入ERK1/2或NF—kB的抑制剂后,IRS—1的酪氨酸磷酸化水平及膜蛋白GLUT—4的表达仅能部分逆转。结论:基础状态下及LPS刺激下,ERK1/2/NF—κB信号通路是睾酮引起胰岛素抵抗的途径之一。