论文部分内容阅读
背景：腰椎间盘突出症是骨科的常见病症之一，以腰腿痛为主要临床表现，严重影响患者的生活质量。而腰椎0020间盘突出症主要是由于椎间盘退变引起的，在退变的椎间盘中，有大量的髓核细胞凋亡。有研究显示，体外转染携带hIGF-1基因的腺病毒载体可明显抑制兔软骨细胞凋亡，这表明其可抑制软骨类细胞-髓核细胞的凋亡。目的：本实验通过建立家兔的体外培养模型，利用TNF-α诱导髓核细胞凋亡，用携带hIGF-1基因腺病毒载体转染进行干预，探讨胰岛素样生长因子-1（IGF-1）基因对髓核细胞凋亡的抑制作用，揭示其抗凋亡机制，为IGF-1基因治疗腰椎间盘退变提供理论依据。方法：1.从健康家兔取出椎间盘髓核，用Ⅱ型胶原酶消化法分离原代椎间盘髓核细胞后，单层培养并以胰酶消化法传代，采用差速贴壁法进行纯化。2.构建携带hIGF-1基因腺病毒载体，由深圳市百恩威生物科技有限公司代为构建。3.按空白组、Ad-IGF-1组（携带hIGF-1基因腺病毒载体和T0020NF-α共同作用）、TNF-α组（仅TNF-α因子作用）进行分组处理。4.利用荧光显微镜观察病毒载体转染情况，Western-blot检测hIGF-1蛋白，rt-PCR技术检测hIGF-1mRNA；利用光学显微镜、原位末端标记（TUNEL）进行观察，利用流式细胞仪（Annexin-v/PI双染）、测定细胞早期以及晚期凋亡率作为凋亡检测6307标。结果：1.荧光显微镜下观察，细胞转染成功，大部分细胞带有绿色荧光；Western-blot检测Ad-hIGF-1组有hIGF-1蛋白表达，而空白组及TNF-α无表达；rt-PCR检测Ad-hIGF-1组有hIGF-1mRNA表达，而空白组及TNF-α无hI0047F-1mRNA表达。2.流式细胞仪检测显示：空白组早期凋亡率为（0.62±0.12）%，晚期凋亡率为（0.29±0.06）%；Ad-hIGF-1组早期凋亡率为（6.47±1.13）%，晚期凋亡率为（10.68±3.42）%；TNF-α组早期凋亡率凋亡率为（34.40±4.42）%，晚期凋亡率为（13.95±4.86）%与空白组比较TNF-α组，凋亡率明显增加，差异有显著性（P<0.01）；与Ad-hIGF-1组比较，TNF-α组凋亡率明显增加，差异有显著性（P<0.05）。3.原位末端标记检测显示：空白组凋亡率为（0.40±0.15）%，Ad-hIGF-1组凋亡率为（6.59±1.03）%，TNF-α组凋亡率为（34.24±4.60）%，与空白组比较TNF-α组，凋亡率明显增加，差异有显著性（P<0.01）；与Ad-hIGF-1组比较，TNF-α组凋亡率明显增加，差异有显著性（P<0.01）。结论：1.本实验成功进行了携带hIGF-1基因腺病毒载体对髓核细胞的体外转染，荧光显微镜观察，转染24h绿色荧光最强，48h后荧光减弱，72h后荧光消失。2.TNF-α可以诱导体外髓核细胞凋亡。3. hIGF-1基因对髓核细胞凋亡有抑制作用。