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肺癌是是世界范围内发病率最高的恶性肿瘤,其中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)占全部肺癌的80%以上,居肿瘤死亡原因之首。NSCLC生物学特征为易发生局部浸润和远处转移,多数患者在诊断时已处于局部晚期或有远处转移,整体五年生存率仅15%。对于此部分患者,第三代新药联合铂类为的化疗是一线治疗,对顺铂敏感性下降是疗效降低的主要原因,往往导致治疗失败。因此,迫切需要探索新的治疗方案。既往的临床试验研究证实许多自中草药具有有效抗肿瘤作用,许多中药也已经用于肿瘤的辅助治疗。蟾毒灵作为中草药蟾酥的提取物之一,相对分子质量为386.5,属强心甙类物质。研究发现,其可以通过调控不同的分子通路对多种实体肿瘤如胰腺癌、胃癌、乳腺癌产生抗瘤作用,也有研究证实蟾毒灵可抑制肺癌细胞的增殖,但其机制尚不明确。此外,另有研究表明蟾毒灵具有化疗增敏作用,甚至可以逆转肿瘤细胞的耐药性。然而,蟾毒灵对NSCLC细胞的抗肿瘤机制以及化疗增敏作用尚不明确。本实验旨在研究蟾毒灵对NSCLC细胞的作用及潜在分子机制,探索蟾毒灵对NSCLC顺铂化疗敏感性的影响及可能参与机制,我们选用A549和H1975这两株NSCLC细胞为模型,分三个部分进行研究。第一部分蟾毒灵对非小细胞肺癌A549和H1975细胞增殖的影响目的：研究蟾毒灵是否抑制NSCLC细胞增殖能力及迁移能力。方法：利用不同浓度的蟾毒灵分别处理A549和H1975细胞24h、48h和72h,采用CCK-8法检测细胞增殖活性的改变,采用划痕实验观察细胞迁移能力改变。结果：A549和H1975细胞经不同浓度(2.5nM,5nM,10nM,20nM,40nM, 80nM,100nM,200nM)的蟾毒灵处理后,两株细胞均呈现为：经低浓度蟾毒灵(2.5nM,5nM)处理后细胞存活率在98%左右,表明细胞增殖能力无明显抑制；细胞经较高浓度(10-200nM)蟾毒灵处理后,细胞增殖受到明显抑制且这种抑制作用随着蟾毒灵浓度的增加,细胞的增殖抑制率增加,蟾毒灵的作用于细胞的时间的越长,细胞的增殖抑制越明显。划痕实验结果表明,细胞经蟾毒灵处理后,细胞迁移能力下降,划痕愈合能力降低,且药物浓度越高,对细胞迁移能力抑制越明显。结论：蟾毒灵可以诱导A549和H1975细胞产生与浓度和作用时间相关的增殖抑制与迁移能力下降。第二部分蟾毒灵对非小细胞肺癌细胞凋亡的影响及可能的分子机制目的：研究蟾毒灵对A549和H1975细胞凋亡的影响及可能参与机制。方法：以不同浓度的蟾毒灵(OnM,10nM,20nM)作用于A549和H1975细胞48h,采用流式细胞术检测药物对细胞凋亡比率影响;采用Western blotting技术检测A549和H1975细胞中凋亡蛋白parp及Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白(3-catenin及其下游分子c-myc和cyclinD1的表达,以及干细胞标记Oct-4表达水平。结果：对细胞凋亡比率的检测结果表明,两株细胞均表现为：随着蟾毒灵浓度的增加,细胞的凋亡比率呈现增加趋势,这个现象说明蟾毒灵可以诱导细胞凋亡,且药物浓度越高,凋亡比率越高。Western blotting显示,药物处理后,PARP被降解,而cleaved-PARP表达水平升高；Wnt/ β-catenin信号通路(3-catenin及其下游分子c-myc和cyclinD1表达均下调,肿瘤干细胞标记Oct-4表达也降低。且药物浓度越高,蛋白表达降低越明显。结论：蟾毒灵在A549和H1975细胞中可能是可能是通过抑制Wnt/p-catenin信号通路的活化,降低(3-catenin及下游分子的表达以及抑制肿瘤干细胞亚群比例,进而诱导细胞凋亡增加。第三部分蟾毒灵对非小细胞肺癌细胞的顺铂化疗增敏作用及可能分子机制目的：研究蟾蜍灵是否可增加A549和H1975细胞的顺铂敏感性及其潜在分子机制。方法：本文第一部分结果可知,NSCLC细胞经低浓度蟾毒灵(2.5nM,5nM)处理后存活率在98%左右,低浓度蟾毒灵对细胞增殖能力无明显影响。采用CCK-8法检测低浓度蟾毒灵、顺铂单药及联合分别作用于A549和H1975细胞48h后细胞增殖活性变化；采用流式细胞仪检测蟾毒灵、顺铂单药及联合处理A549细胞(蟾毒灵5nM、顺铂5μg/mL)与H1975细胞(蟾毒灵5nM、顺铂1μg/mL) 48 h后细胞凋亡比率；采用Western blotting检测蟾毒灵、顺铂单药及联合处理后A549和H1975细胞中NF-κB及其下游分子c-myc表达水平的改变。结果：两株细胞经上述处理后均表现为：与单独应用顺铂相比,低浓度蟾毒灵与顺铂联合应用可明显增加顺铂对A549与H1975细胞的增殖抑制作用。流式检测结果显示,低浓度蟾毒灵组无明显细胞凋亡诱导作用,而联合组细胞凋亡比率明显大于顺铂组,说明低浓度蟾毒灵可以增加A549与H1975细胞对顺铂的药物敏感性。低浓度蟾蜍灵与顺铂联合组细胞NF-κB及其下游分子c-myc蛋白表达水平较顺铂单药组明显降低。结论：抑制NF-κB通路的活化以及下游分子c-myc的表达是低浓度蟾毒灵增加A549与H1975细胞对顺铂的敏感性的机制之一