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本文主要在前人的研究基础上,对以两种不同材料作为外植体的根癌农杆菌介导的棉花遗传转化体系进行了进一步并且较为全面的研究探索,最终建立了两套比较完善实用的转化系统,并且对运用花粉管通道法对棉花进行遗传转化的技术进行了初步的探索。
首先以珂字棉312品种作为材料,利用其下胚轴为外植体,将irrE基因通过农杆菌介导法转入其中。在实验过程中,对可能影响遗传转化结果的一些因素分别进行了研究讨论,最终建立了一套比较完善可行的以棉花下胚轴为外植体材料的农杆菌介导的遗传转化体系。
在外植体生长的每一个阶段都用一定浓度的卡那霉素进行筛选,在经过大约10个月后,其中萌发得到的再生苗为48株,出苗率约为1.05％;最后再用低浓度的卡那霉素对再生小苗进行筛选,存活的再生苗约为35株,初步得到的转基因阳性率约为72.92％。
其次以中棉所24品种作为材料,利用其胚性愈伤组织为外植体,将irrE基因通过农杆菌介导法转入其中。经过研究探讨,最终也建立了一套比较完善可行的以棉花胚性愈伤组织为外植体材料的农杆菌介导的遗传转化体系。
在经过转化的胚性愈伤组织生长的每一个阶段都用一定浓度的卡那霉素进行筛选,在经过大约7个月后,其中萌发得到的再生苗为27株,出苗率约为6.92％；最后再用低浓度的卡那霉素对再生小苗进行筛选,存活的再生苗约为18株,初步得到的转基因阳性率约为66.67％。
最后运用花粉管通道法将GbVe1和GbVe2基因,分别转入中棉所24和冀棉14中。收获转化过的棉株种子,将其种到营养钵中,在幼苗真叶期用0.8％的卡那霉素溶液涂抹第一或第二真叶。一周后观察叶片现象,进行初步筛选。经过卡那霉素的初步鉴定,得到了具有卡那霉素抗性的中棉所24,9株,冀棉14,4株,转基因成功率分别约为31.03％和26.67％。