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背景长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA),是一种调控性非编码RNA,其长度超过200nt,具有一定生物学功能但缺乏编码蛋白质的能力,主要通过表观遗传、转录调控以及转录后调控的方式导致基因沉默或激活。与miRNA或蛋白质不同,lncRNA功能目前不能从序列或结构推断,lncRNA在多个水平调控基因复制、转录、翻译以及蛋白质的功能,进而发挥独特的生物学功能,其可与转录因子结合调控相应靶基因的表达;可通过结合miRNA效应复合物上的靶位点,使miRNA失去调节基因表达的功能;可以特异性的与调节蛋白结合形成核酸蛋白质复合体,进而影响目标蛋白的功能;招募DNA靶标染色质修饰复合物影响DNA转录;通过参与mRNA的剪切和加工,实现翻译抑制、剪切拼接以及mRNA降解等功能。大量研究已经确定了lncRNA的异常表达与特定疾病状态之间的关联,特别是在肿瘤相关研究中。然而,有关lncRNA与POI的研究还非常的少。颗粒细胞在卵泡发育,卵母细胞成熟和卵泡闭锁中起重要作用,它们在卵泡不同发育阶段形成的各种激素和细胞因子的作用下增殖,分化和凋亡,对卵泡发育具有不可替代的调节作用。在许多卵巢相关疾病中,都已经观察到颗粒细胞的异常状态。有研究表明原发性卵巢功能不全(primary ovarian insufficiency,POI)患者的卵巢颗粒细胞在基因水平、分子水平和组织水平均表现出凋亡状态。POI是指女性在40岁前出现卵巢功能衰退现象的临床综合征,以月经紊乱,停经或月经稀发,同时伴有高促性腺激素和低雌激素的特点。POI的病因非常复杂,主要包括遗传性疾病,自身免疫性疾病,生殖道结核,吸烟,卵巢手术,放射和/或化疗,其中化疗导致的POI占比7%,有研究显示,儿童及青少年癌症幸存者中POI的患病率为10.9%。本课题组前期研究表明,高通量二代测序结果显示POI患者卵巢皮质组织中lnc-GULP1-2:1和COL3A1的表达明显低于正常卵巢皮质组织。Lnc-GULP1-2:1位于COL3A1的5’端,共表达网络分析预测COL3A1是lnc-GULP1-2:1的顺式靶向转录物。目的探索lnc-GULP1-2:1在卵巢颗粒细胞中的作用;检测lnc-GULP1-2:1对颗粒细胞增殖作用的影响;研究lnc-GULP1-2:1与COL3A1的相互作用;初步探索lnc-GULP1-2:1/COL3A1在顺铂导致的POI发生发展过程中的调控机制。方法本研究运用RT-PCR检测不同卵巢功能储备患者的颗粒细胞中lnc-GULP1-2:1/COL3A1的相对表达水平;运用FISH技术检测lnc-GULP1-2:1在人原代卵巢颗粒细胞中的定位及表达;运用慢病毒构建稳定过表达lnc-GULP1-2:1的KGN稳转系,检测lnc-GULP1-2:1的过表达对KGN增殖与凋亡的影响;运用COL3A1siRNA处理细胞,研究其对细胞中lnc-GULP1-2:1表达的影响以及对KGN增殖与凋亡的影响;运用顺铂模拟化疗时颗粒细胞的状态,检测其对基因表达及细胞增殖的影响。结果1.PCOS患者的颗粒细胞中lnc-GULP1-2:1的表达明显高于正常对照组,而DOR患者的表达水平相对较低;lnc-GULP1-2:1在颗粒细胞中的表达主要集中于细胞质,但在核中特定位置也有明确的点状表达。2.lnc-GULP1-2:1的过表达能够抑制KGN细胞的增殖,促凋亡基因Bax表达显著上调,细胞周期相关蛋白CCND2表达明显下降,而细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂P16表达明显上调。3.PCOS患者颗粒细胞中COL3A1的表达明显高于正常对照组,在DOR患者中的表达水平相对较低;lnc-GULP1-2:1的过表达能够促进COL3A1 mRNA及蛋白水平的表达;lnc-GULP1-2:1的过表达使COL3A1蛋白的亚细胞定位发生明显改变,在核中的表达明显增多。4.KGN中运用siRNA人为下调COL3A1的表达可显著抑制KGN的增殖,但对lnc-GULP1-2:1的表达没有明显影响;上调lnc-GULP1-2:1表达与下调COL3A1的表达能够协同抑制KGN的增殖并改变增殖与凋亡相关基因的表达。5.化疗药顺铂能够显著抑制KGN细胞的增殖,并促进Bax的表达,抑制Bcl-2、Bcl-XL基因的表达,下调细胞周期相关蛋白CCND2的表达,并且上调细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂P16的表达;顺铂作用于KGN能够上调lncGULP1-2:1的表达,抑制COL3A1的表达,并且随时间延长其作用更明显;lncGULP1-2:1的过表达能够增强顺铂对KGN细胞增殖的抑制作用。结论Lnc-GULP1-2:1的过表达能够改变颗粒细胞内COL3A1蛋白的分布,使核中COL3A1蛋白表达增加,影响细胞周期相关蛋白的表达,从而抑制颗粒细胞增殖。顺铂能够通过两种方式抑制颗粒细胞增殖,即上调lnc-GULP1-2:1的表达,影响COL3A1蛋白的细胞内定位,还能够直接下调细胞内COL3A1 mRNA及蛋白的表达,影响细胞周期相关蛋白的表达,进而抑制颗粒细胞增殖。