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缺血再灌注(I/R)的概念是McCord于1985年首次提出的，它是指机体组织在急性缺血一段时间后，对组织代谢、结构和功能造成的损伤并没有随着血流的恢复而恢复，而是不断加重，甚至出现了不可逆的损伤乃至坏死的状态。骨骼肌缺血再灌注损伤在临床上很常见，且常常引起患者的肌肉坏死和功能障碍，造成患者的残疾甚至危及生命。再灌注损伤不仅可以导致局部组织第二次打击，还能导致远隔器官(如肾、肺等)的继发性的损伤，有较高的致残率和致死率，成为血管外科、骨科、创伤外科急需解决的问题。目前，临床上下肢缺血再灌注后最常见的并发症为骨筋膜室综合症以及急性肾功能衰竭，严重影响治疗效果，影响着病人的生存期限及生存质量。因此，研究骨骼肌缺血再灌注损伤的发病机理同时寻找更加有效的治疗方法成为为广大医务人员的迫切任务。 近年来众多学者已经致力于研究骨骼肌缺血再灌注损伤的发病机制，随着对炎症反应综合征研究的不断深入，发现了众多的炎症介质、白细胞、血管内皮细胞是触发这一类损伤反应的关键，而氧自由基损伤，及细胞钙超载，则处于上述系列炎症损伤的下游环节。针对损伤后防治的研究较多，但真正能够适用于临床且效果明显的很少。缺血预处理目前被认为是减轻缺血再灌注损伤最有效的方法之一。是1986年Murry等首次提出的内源性心脏保护机制的概念，但由于心肌缺血发生时间的不可预知性，缺血预处理在临床应用上受到很大的限制.相比之下，在再灌注期间实施的心脏保护措施更具有临床可行性。2003年，Zhao等报道了另外一种内源性心脏保护机制，即在较长心肌缺血后，在再灌注开始之前，立刻给予多个周期的短暂停灌、复灌处理，具有与缺血预处理相似的心脏保护作用，并将此现象称为缺血后处理。 药物预处理、后处理是最近提出的一种心肌保护的新策略，同传统的缺血预处理及缺血后处理一样，药物预处理及后处理具有明显的心肌保护作用，尤其是药物后处理是在缺血后进行的一种药物干预的治疗措施，更具有实践性、科学性和伦理性，在心肌保护方面有着更重要的基础研究意义和更为广泛的临床应用前景，有学者认为“药物后处理”可能会是心肌缺血后处理临床应用的一个方向。本研究将缺血预处理、后处理及药物处理引入骨骼肌缺血再灌注损伤的研究中，将有助于解决日益增多的下肢缺血性疾病的治疗难题。 祖国的中医中药已被临床广泛应用于众多炎症反应性疾病，对再灌注损伤的治疗取得了一定进展。血必净是由红花、赤芍、丹参、当归、川芎5味中药提取物组成的复方的中药制剂，其有效成分主要为红花黄色素A、川芎嗪、丹参素、阿魏酸、芍药苷等。这些成分的综合作用构成了血必净的药理学基础；随着分子生物学技术的发展及中医理论现代化的进展，中医学已逐步从临床经验总结过度为基础实验研究，步入了实验医学的新时代。因此针对血必净在骨骼肌缺血再灌注损伤的作用机制的研究被列入本研究内容之中。 本课题从三方面进行了研究：(1)通过观察不同缺血时间下再灌注后的骨骼肌组织学及超微结构的变化、丙二醛(MDA)、髓过氧化物酶(MPO)的水平及骨骼肌水肿情况，探讨氧自由基及炎性细胞对骨骼肌缺血再灌注损伤的影响(2)应用病理组织学方法、免疫组织化学技术、Western-blot及Real-time PCR技术研究骨骼肌缺血后不同再灌注时间内肾损伤情况，同时观察了MDA水平及核因子-κB(NFκB)、细胞间粘附分子-1(ICAM-1)的表达变化。(3)探讨了缺血预处理、后处理及血必净对骨骼肌缺血再灌注肾损伤的影响及其作用机制。 第一部分、大鼠骨骼肌缺血再灌注损伤及其机制的实验研究 目的：通过研究在不同缺血时间下再灌注后的骨骼肌变化情况、氧自由基产生及炎性细胞浸润程度，以期进一步阐明骨骼肌缺血再灌注损伤的作用机制，为临床治疗骨骼肌IRI提供理论依据。 方法：健康清洁级wister雄性大鼠24只，制备后肢缺血再灌注损伤模型，随机分4组，每组6只动物。对照组：仅进行常规麻醉，不阻断后肢血流9h处理动物；实验1组：止血带完全阻断后肢血流2h，松解阻断3h后处理动物。实验2组：止血带完全阻断后肢血流4h，松解阻断3h后处理动物。实验3组：止血带完全阻断后肢血流6h，松解阻断3h后处理动物。 应用HE染色和透射电镜技术观察骨骼肌损伤情况，并检测血清乳酸脱氢酶(LDH)及肌组织MDA、MPO、干湿比值，分析比较不同缺血时间再灌注后组织损伤的差异。 结果：(1)实验一组血清中LDH含量轻度升高(164.96±35.32)，与对照组(137.07±6.47)比较差异无显著性(P>0.05)；实验二组(1959.20±163.09)、实验三组(3397.41±304.82)与对照组比较，血清中LDH含量明显升高，以实验三组最明显，其差异均有显著性(P<0.05)。(2)骨骼肌组织匀浆MDA、MPO在对照组及实验一、二、三组的含量分别为(1.67±0.52，1.48±0.67)；(3.60±0.64，2.81±0.32)；(11.66±1.87，3.68±0.49)；(21.70±4.36，5.04±0.64)。实验一组、实验二组、实验三组与对照组比较，肌组织中MDA、MPO含量明显升高，以实验三组最明显，其差异均有显著性(P<0.05)。实验三组骨骼肌湿重/干重比值最高，其次依次为实验二组、实验一组，对照组湿重/干重比值最低(P<0.05)。(3)病理组织学可见随着缺血时间的延长，骨骼肌组织损伤逐渐加重。透射电镜可见随着缺血时间的延长，线粒体嵴膜融合，模糊不清，直至线粒体嵴缺失，肌组织变性坏死，可见肌节、肌纤维等结构消失。 结论：氧自由基及炎性细胞参与并加重了骨骼肌缺血再灌注损伤，缺血时间越长，组织损伤程度越重。 第二部分、大鼠骨骼肌缺血再灌注后远隔肾损伤及其机制的实验研究 目的：通过研究骨骼肌缺血后不同再灌注时间内肾损伤情况，探求骨骼肌缺血再灌注远隔肾损伤的作用机制，为临床治疗骨骼肌缺血再灌注肾损伤提供理论依据。 方法：健康清洁级wister雄性大鼠30只，制备后肢缺血再灌注损伤模型，随机分5组，每组6只动物。对照组(A)：仅进行常规麻醉，不阻断后肢血流13h处理动物；缺血组(B)：止血带完全阻断后肢血流4h后处理动物；缺血再灌注1组(C)：止血带完全阻断后肢血流4h，松解阻断3h后处理动物；缺血再灌注2组(D)：止血带完全阻断后肢血流4h，松解阻断6h后处理动物；缺血再灌注3组(E)：止血带完全阻断后肢血流4h，松解阻断9h后处理动物。取肾组织采用HE染色，观察组织形态的改变，免疫组织化学染色，观察NF-κB及ICAM-1在肾组织的表达情况；同时采用Western blot检测各组肾组织中ICAM-1、NF-κ B的含量，采用SPSS13.0进行单因素方差分析，检验水准取P<0.05。 结果：血清乳酸脱氢酶、肌酐含量的变化情况：B、C、D、E组血清中LDH依次升高，以E组最明显，与A组比较差异均有显著性(P<0.05)，D与E组血清中LDH含量比较，差异无显著性(P>0.05)；B组肌酐含量无明显变化，与A组比较差异无显著性(P>0.05)，C、D、E组血清中Cr含量明显升高，与A、B组比较差异均有显著性(P<0.05)。肾组织匀浆丙二醛含量、髓过氧化物酶含量的变化情况：B组、C组、D组、E组与A组比较，血清中MDA含量明显升高，其差异均有显著性(P<0.05)，D与E组血清中MDA含量比较，差异无显著性(P>0.05)，肾组织MPO含量，A组与B组，D组与E组比较差异无显著性(P>0.05)，C、D、E组与A、B组比较差异有显著性(P<0.05)。各组肾组织病理组织学形态变化：C、D组损伤逐渐加重，D、E组变化不明显。NF-κ B、ICAM-1在肾小管上皮细胞表达情况：A组未见阳性细胞表达；B组可见肾小管上皮细胞内呈淡黄色细颗粒状，呈弱阳性表达；C组于肾小管上皮细胞内见棕黄色颗粒呈阳性表达，D组见肾小管上皮细胞内棕褐色颗粒呈强阳性表达；E组亦可见肾小管上皮细胞内棕褐色颗粒，呈强阳性表达。Western blot检测5组肾组织中NF-κ B、ICAM-1的蛋白含量(0.15±0.02，0.17±0.03)；(0.65±0.07，0.49±0.04)；(1.07±0.07，0.95±0.02)；(1.37±0.18，1.24±0.07)；(1.47±0.20，1.26±0.06)。B、C、D、E组NF-κ B、ICAM-1的蛋白含量依次增加，与A组比较差异具有显著性(P<0.05)D组E组比较差异无统计学意义(P>0.05)。 结论： 1、骨骼肌缺血再灌注损伤，在本实验所设定的条件下确实引起了远隔肾脏损伤。 2、NF-κB、ICAM-1参与了骨骼肌缺血再灌注肾损伤。 3、骨骼肌缺血再灌注损伤早期，氧自由基、炎性因子的作用是导致缺血再灌注肾损伤的主要原因。 4、本实验所造成的肾损伤中未发现肾小管管型存在。推测可能与肾损伤程度较轻或观察的时间较短有关。有待于进一步的研究。 第三部分、缺血预处理、后处理以及血必净对骨骼肌缺血再灌注肾损伤的保护作用的实验研究 目的：本课题前期的系列研究发现，骨骼肌I/R损伤确实引起了远隔肾脏损伤，氧自由基、炎性因子参与了骨骼肌I/R肾损伤。为了探讨骨骼肌I/R损伤后的保护措施，本部分实验制备了骨骼肌I/R肾损伤模型，对缺血预处理、后处理及药物预处理和后处理对骨骼肌I/R肾损伤的保护作用进行了研究。 方法：健康清洁级wister雄性大鼠42只，制备后肢缺血再灌注损伤模型，随机分7组，每组6只动物。对照组(A)：仅进行常规麻醉，不阻断后肢血流10h处理动物；缺血组(B)：止血带完全阻断后肢血流4h后处理动物；I/R组(C)：止血带完全阻断后肢血流4h，松解阻断6h后处理动物；预处理组(D)：完全阻断后肢血流前给予5min缺血，5min再灌注，重复三次后，再阻后肢血流3h45min，松解阻断5h45min后处理动物；后处理组(E)：止血带完全阻断后肢血流3h57min，完全松解阻断前给予1min再灌注，1min缺血重复三次后再灌注5h57min后处理动物；I/R低剂量血必净组(F)：即阻断后肢血流致缺血4h再灌注6h，于缺血前10min及再灌注开始时即刻经尾静脉注射血必净(各8mL/kg)进行治疗；I/R高剂量血必净组(G)：即阻断后肢血流致缺血4h再灌注6h，于缺血前10min及再灌注开始时即刻经尾静脉注射血必净(各16mL/kg)进行治疗。取肾组织采用免疫组织化学染色，观察NF-κ B及ICAM-1在肾组织的表达情况；同时采用Western blot及RT-PCR方法检测各组肾组织中ICAM-1、NF-κB的含量，采用SPSS13.0进行单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。 结果：血清LDH、肌酐(Cr)含量的变化情况：B、C组血清中LDH依次升高，以C组最明显，与A比较差异均有显著性(P<0.05)，D、E、F、G组血清中LDH含量明显下降，分别与A组及C组比较差异均有显著性(P<0.05)；B组Cr含量无明显变化，与A组比较差异无显著性(P>0.05)，C组Cr最高，与D、E、F、G组比较其差异具有显著性(P<0.05)，D、E、F、G组血清中Cr含量与A组比较差异亦具有显著性(P<0.05)，D、E组Cr与B组比较差异无显著性(P>0.05)，F、G组与B组比较差异有显著性(P<0.05)，F组与G组比较差异无显著性(P>0.05)。肾组织匀浆MDA含量、MPO含量的变化情况：B、C、D、E、F、G组与A组比较，血清中MDA含量均升高，以C组升高最明显，其差异均有显著性(P<0.05)，D、E、F、G组MDA含量与C组比较，其差异亦具有显著性；肾组织MPO含量，A组与B组比较差异无显著性(P>0.05)，C组含量最高，与其余各组比较差异均有显著性(P<0.05)。NF-κ B、ICAM-1在肾小管上皮细胞表达情况：A组未见阳性细胞表达；B组可见肾小管上皮细胞内呈淡黄色细颗粒状，呈弱阳性表达；C组于肾小管上皮细胞内棕褐色颗粒呈强阳性表达；D组、E组、F组、G组见肾小管上皮细胞内见棕黄色颗粒呈阳性表达；B、C、D、E、F、G组NF-κ B、ICAM-1的蛋白含量(0.54±0.03，0.60±0.06)、(2.07±0.18，2.40±0.09)、(0.95±0.12，1.08±0.10)、(0.76±0.12，0.85±0.06)、(1.09±0.11，1.31±0.12)、(1.16±0.13，1.53±0.15)；较A组(0.18±0.03，0.20±0.02)均有增加，以C组含量最高，与A组比较差异均具有显著性(P<0.05)，D、E、F、G组与C组比较差异亦具有显著性(P<0.05)。NF-kB、ICAM-1基因的相对表达量7组分别为A(1.33±0.41，0.75±0.18)、B(5.41±0.65，4.01±0.56)、C(17.94±2.84，13.595±1.56)、D(9.19±1.92，6.99±1.60)、E(7.72±1.87，6.18±0.95)、F(11.60±2.13，9.12±1.42)、G(12.19±1.91，10.61±1.53)。其中C组最高，与A、B、D、E、F、G组比较差异均具有显著性(P<0.05)，而F组与G组比较差异无显著性(P>0.05)。 结论： 1.骨骼肌缺血预处理、后处理可以减轻骨骼肌缺血再灌注肾损伤。 2、血必净可以减轻骨骼肌缺血再灌注肾损伤，且与本实验所设计的剂量无关。 3、骨骼肌缺血预处理、后处理、血必净部分地通过减少NF-Kb、ICAM-1的表达而起作用。 基于上述三部分的研究可以得出以下结论：本实验中氧自由基及炎性因子参与并加重了骨骼肌缺血再灌注损伤；骨骼肌缺血再灌注损伤引起了远隔肾脏损伤；缺血预处理、后处理、血必净可以减轻骨骼肌缺血再灌注肾损伤，且它们部分地通过减少NF-Kb、ICAM-1的表达而起作用。