用RNAi技术研究果蝇14-3-3ξ可变剪接的调控蛋白

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剪接是RNA转录后的一种重要的加工机制,而可变剪接是通过不同的剪接方式增加蛋白质的多样性的一种重要途径。目前发现的可变剪接主要有七种形式,互斥剪接是其中的一种,占全部剪接事件的10%,其特点在于只能从一个外显子组中选择一个互斥外显子进入成熟的mRNA,因而可以通过选择不同的互斥外显子形成不同的mRNA,进而形成不同的蛋白质。目前,许多学者对互斥剪接的调控机制进行了研究,并提出了几种调控模型,但具体的调控机制还有待研究。   14-3-3基因家族是真核生物中保守存在的调控分子,并参与多种重要的生物途径。14-3-3ζ14-3-3基因家族的成员,在黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)中,其第五外显子组含有三个互斥外显子.本实验室先前的研究发现mRNA的二级结构对其互斥可变剪接起着重要的调控作用。为了进一步深入研究该调控机制,本实验通过在S2细胞中建立RNA干扰体系,筛选出了参与果蝇14-3-3ζ基因互斥剪接的调控因子。本实验将双链RNA转染果蝇S2细胞后通过半定量RT-PCR检测干扰效果,通过实验发现影响干扰效果的主要因素有:双链RNA的量,转染时间和转染频率。通过梯度实验发现转染20μg双链RNA三日后能够达到较好的干扰效果,这对于后续的研究提供了较好的平台。利用此干扰体系筛选参与果蝇14-3-3ζ基因互斥剪接的调控因子的研究结果表明,干扰调控蛋白Hrp36、Hrp38、Hrp48、SC35和Rbp1-like后,RT-PCR均出现了两个互斥外显子相连的非正常剪接情况,而干扰其他蛋白则没有出现这种情况,因此,这五种蛋白可能对14-3-3ζ基因互斥剪接的调控起重要作用,这对14-3-3ζ基因互斥剪接调控机制的研究打下了坚实的基础。
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