【摘 要】
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乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV),又称乙脑病毒,是一种黄病毒属虫媒病毒,该属还有其它重要的致病性黄病毒,包括西尼罗河病毒(WNV)、蜱传脑炎病毒(TBEV)登革热
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乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV),又称乙脑病毒,是一种黄病毒属虫媒病毒,该属还有其它重要的致病性黄病毒,包括西尼罗河病毒(WNV)、蜱传脑炎病毒(TBEV)登革热病毒(DENV)和黄热病毒(YFV)等。乙脑病毒可以感染人和多种动物,是一种重要的人兽共患传染病,乙型脑炎(Japanese encephalitis,JE)简称乙脑。目前,全世界有将近30亿人口生活在乙脑疫区,该病已经成为危害公共卫生健康的重要疫病。然而,迄今为止仍未有针对乙脑的治疗药物被开发,疫苗免疫接种是控制该病最好的方法。由于乙脑只在亚洲等国家和地区流行,欧美等发达国家很少关注该病,因此该病的研究远远落后于DENV和WNV等。目前为止,乙型脑炎病毒的生命周期和致病机制尚未完全明了。在乙脑病毒的生命周期中存在着广泛与宿主的相互作用,这些相互作用是乙脑病毒完成感染和增殖所必须的。E蛋白作为病毒的主要表面结构蛋白,参与病毒的吸附和入侵、包装、出芽以及释放等生命周期,同时也是决定病毒毒力和抗原性的主要蛋白。解析E蛋白与宿主蛋白相互作用,有助于更好地探索乙脑病毒的生命周期和致病机制,同时还能为抗病毒药物和新型疫苗的研发提供思路。本研究以乙脑病毒强毒株BJB和疫苗株SA14-14-2的E蛋白为研究对象,首先构建了带FLAG和Strep双标签的JEV E蛋白的真核表达载体。将该表达载体转染293T细胞,进而利用Pull Down技术获得可能与E蛋白发生相互作用的蛋白复合物,再通过LC-MS/MS技术鉴定,最终获得81个可能与E蛋白相互作用的宿主蛋白。我们选取了宿主蛋白赖氨酸tRNA的合成酶(Lysine--tRNA ligase,KARS)进行下一步研究。通过免疫共沉淀技术和双分子荧光实验,确定了KARS蛋白与乙脑病毒强毒株BJB E蛋白相互作用,并且确定了两者相互作用区域为KARS的氨酰化结构域和BJB E 1-193aa;而激光共聚焦则显示两者共定位于细胞质。通过RNAi技术,抑制KARS蛋白的表达,则发现促进了BJB在生命周期晚期的增殖。进一步证明了宿主氨基酰-tRNA合成酶多功能复合体蛋白2(Aminoacyl t RNA synthase complex-interacting multifunctional protein 2,AIMP2)与KARS和BJB E同时存在的相互作用关系。随后,通过CRISPR-Cas9技术,抑制KARS和AIMP2的表达,同样促进了病毒在生命周期晚期的增殖。综上所述,我们的研究筛选出了81个与JEV E互作的宿主蛋白,有助于建立E蛋白与宿主互作网络,为研究E蛋白与宿主细胞的相互作用提供了重要线索和依据。同时确定了KARS和AIMP2蛋白与E蛋白的相互作用关系,并且确定了KARS和AIMP2蛋白能抑制病毒生命周期晚期的增殖。为进一步探索E蛋白与宿主蛋白的相互作用,在乙脑病毒生命周期和致病机制中的生物学功能及分子机制打下了基础。
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