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以往的研究发现,抗肿瘤药物、氧化应激等诱导肿瘤细胞内质网应激,通过IRE1(inositol-requiring enzyme 1,肌醇需要酶1)和PERK(PKR-like ER kinase,PKR样内质网激酶)的未折叠蛋白反应及一个钙介导的信号级联反应激活自噬。被激活的自噬是发挥保护作用还是具有细胞毒性以及自噬调节细胞死亡的机制尚需要进一步探讨。本课题在维生素K3在诱导Hela细胞凋亡同时发生了自噬等前期工作的基础上,重点探讨内质网应激在氧化应激诱导细胞自噬中的作用及其相关机制,进一步揭示肿瘤细胞应答应激的能力及其调控机制。研究内容如下:利用维生素K3(Menadione)制作氧化应激模型,以人宫颈癌Hela细胞为研究对象,分别采用醌类药物代谢抑制剂(Dicoumarol),内质网应激诱导剂(Tunicamycin)和内质网应激抑制剂(TUDC),JNK抑制剂(SP600125),MEK抑制剂(U0126)。利用MTT法检测细胞存活率;DCFH-DA染色,共聚焦显微镜观察细胞内活性氧簇(reactive oxygen species,ROS);透射电镜观察内质网等细胞器形态学变化;Western blotting观察自噬相关蛋白LC3-II、Atg12-Atg5、内质网应激相关蛋白GRP78、IRE1α、PERK及其下游MAPK途径相关蛋白JNK、ERK的表达。结果表明,维生素K3可能通过其氧化还原反应产生活性氧簇、引起Hela细胞氧化损伤,维生素K3能够诱导细胞发生内质网应激,被激活的内质网应激通过JNK和ERK途径介导自噬发生。利用自噬抑制剂(3-MA),溶酶体抑制剂(NH4Cl,chloroquine),caspase特异性抑制剂(z-VAD-fmk),泛素-蛋白酶体抑制剂(LAC)。采用MTT法检测细胞存活率;光镜观察细胞形态,透射电镜观察内质网等细胞器形态学变化;采用Cathepsin D免疫荧光来检测溶酶体膜通透性;免疫荧光法观察LC3和LAMP1的共定位,检测自噬体与溶酶体融合过程;Western blotting观察自噬相关蛋白Atg12-Atg5、内质网应激相关蛋白GRP78、p62/SQSTM1及泛素和多泛素化蛋白的表达。结果表明,阻断自噬体与溶酶体融合,增加维生素K3诱导的细胞凋亡,伴有caspase激活及溶酶体膜通透性增加;p62/SQSTM1蛋白表达增加,错误折叠蛋白积聚,内质网应激反应延长。依据以上结果,本实验认为维生素K3诱导的氧化应激反应引起蛋白的错误折叠,错误折叠蛋白的积聚激活内质网应激,通过其下游JNK、ERK途径诱导自噬发生;抑制肿瘤细胞的自噬过程能够加重内质网应激,进而促进细胞凋亡,增加了维生素K3引起的氧化应激损伤。泛素化修饰和p62/SQSTM1参与维生素K3诱导的自噬过程,表明自噬在降解氧化应激诱导的错误折叠蛋白过程中可能具有特异性。可见,内质网应激-自噬反应参与了调控肿瘤细胞生存过程,进一步的实验研究能够为肿瘤的治疗提供新的理论依据。