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钙拮抗剂（Calcium antagonists）是一类选择性阻止电压依赖性钙通道，抑制细胞外Ca2+内流，降低细胞内Ca2+浓度的药物。按照化学结构，钙拮抗剂主要分为3类：二氢吡啶类，硫氮杂卓类，苯烷胺类。碘化N-正丁基氟哌啶醇（N-n-butyl haloperidol iodide，F2）是我课题组研究合成的一个新化合物。前期研究表明，F2有拮抗钙超载保护心肌缺血再灌注（ischemia-reperfusion，I/R）损伤或心肌细胞缺氧/复氧（hypoxia/reoxygenation,H/R）损伤的作用。F2能够激活非钙依赖型PKCε转位，保护心肌细胞H/R损伤；此外，在 L-型钙通道缺失的心脏微血管内皮细胞上，F2对H/R损伤依然有保护作用。文献报道，地尔硫卓、氨氯地平和维拉帕米可通过不依赖于改变细胞内钙浓度的途径影响转录因子N F-IL6和N F-κB的活性。上述研究结果提示，钙拮抗剂对心肌细胞H/R损伤具有非钙依赖的保护机制。肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor alpha, TNF-α）作为一种多功能的细胞因子，在炎症反应、免疫应答等多种生理、病理过程中发挥着重要作用。有文献报道，心肌I/R及心肌细胞H/R刺激下，TNF-α激活且表达上调是导致心肌功能紊乱的一重要因素。结合前期的基因芯片数据，在无钙液H/R模型中，TNF-α表达上调，F2处理后TNF-α表达下调。提示我们，TNF-α可能参与无钙液 H/R引起的心肌损伤。因此，本研究首先通过观察无钙液条件下H/R心肌细胞中TNF-α的变化，及钙拮抗剂对TNF-α表达的影响；进一步探讨无钙液H/R时，H9C2心肌细胞是否介导 TNF-α/NF-κB环路以及钙拮抗剂是否可以通过调节此环路保护心肌细胞H/R损伤。 方法： 第一部分钙拮抗剂对无钙液H/R心肌细胞中TNF-α表达的影响 1.将培养的H9C2心肌细胞随机分组：①对照(Ca2+1h)组；②无钙液(0 Ca2+)组；③无钙液缺氧复氧（0 Ca2+H/R）组；④无钙液+不同钙拮抗剂组；⑤无钙液+DMSO组；⑥无钙液H/R+DMSO组；⑦无钙液H/R+不同剂量钙拮抗剂组。 2. Real-Time PCR方法检测H9C2心肌细胞中TNF-αmRNA水平。 3. ELISA方法检测H9C2心肌细胞培养上清液中的TNF-α，IL-6，IL-10浓度。 4.线粒体膜电位（JC-1）方法检测H9C2心肌细胞早期凋亡。 5.比色法检测H9C2心肌细胞中乳酸脱氢酶（LDH）含量。 第二部分钙拮抗剂对无钙液H/R心肌细胞中TNF-α/NF-κB环路的影响 1.将培养的H9C2心肌细胞随机分组：对照（Ca2+1h）组、无钙液1h(0 Ca2+1h)组、无钙液H/R组、无钙液H/R+DMSO组、无钙液H/R+F2组、无钙液H/R+Ver组、无钙液H/R+Dil组、无钙液H/R+Nif组、无钙液H/R+F2+TNF-α组、无钙液H/R+Ver+TNF-α组、无钙液H/R+TNF-α组、无钙液H/R+anti-TNF-αmab组、无钙液1.0h+TNF-α组、无钙液H/R+PDTC组、无钙液H/R+LPS组,、control+P65组、control+vecter组。 2.ELISA方法检测H9C2心肌细胞培养上清液中的TNF-α，IL-6，IL-10浓度。 3.Western-blot法检测无钙液H/R H9C2心肌细胞p-P65，P65，p-IKB-α，IKB-α，p-IKKα/β， IK Kα/β蛋白表达的变化。 4.线粒体膜电位（JC-1）方法检测H9C2心肌细胞早期凋亡。 5.比色法检测H9C2心肌细胞中LDH含量。 6.双荧光素酶报告基因(Dual-Luciferase)检测 H9C2心肌细胞 NF-κB Luciferase，TNF-αpromoter Luciferase荧光比值。 7.免疫荧光检测H9C2心肌细胞NF-κB的核转位。 结果： 第一部分钙拮抗剂对无钙液H/R心肌细胞中TNF-α表达的影响 1.无钙液培养可刺激H9C2心肌细胞生成 TNF-α，无钙液培养1h后随着培养时间的延长释放生成的TNF-α含量逐步升高，钙拮抗剂对无钙液培养所致TNF-α升高无影响。无钙液中加入H0.5h/R0.5h刺激，可明显激活H9C2心肌细胞释放TNF-α，随着无钙液H/R时间的延长，培养液中TNF-α含量逐步升高。同时，无钙液H/R可促进H9C2心肌细胞释放IL-6，LDH及减少IL-10的生成。不同浓度的F2及Ver可剂量依赖地下调无钙液H/R所致心肌细胞TNF-α，IL-6，LDH含量的升高及IL-10的降低，而Dil，N if对TNF-α表达上调无影响。 2.F2及Ver能剂量依赖地抑制无钙液H/R所致H9C2心肌细胞中TNF-α mRNA的表达，而Dil，Nif对TNF-α的mRNA表达无影响。 3.F2及Ver能剂量依赖地抑制无钙液H/R所致H9C2心肌细胞早期凋亡。 第二部分钙拮抗剂对无钙液H/R心肌细胞中TNF-α/NF-κB环路的影响 1.无钙液H/R可激活H9C2心肌细胞p-P65，p-IKB-α，p-IKKα/β蛋白表达，F2及Ver能下调其表达。而Dil，Nif对其表达无影响。 2. TNF-α单克隆抗体可下调无钙液H/R所致p-P65，p-IKB-α，p-IKKα/β的高表达，抑制细胞LDH的漏出，减少早期细胞凋亡，降低炎症因子IL-6，IL-10的释放。重组大鼠TNF-α可拮抗F2及Ver对无钙液H/R心肌细胞p-P65，p-IKB-α，p-IKKα/β蛋白高表达的抑制作用，拮抗F2及ver的心肌保护作用。 3. NF-κB抑制剂PDTC可下调无钙液H/R所致的TNF-α蛋白高表达。 4.无钙液H/R可致NF-κB的信号转录活性上调，促使NF-κB Luciferase，TNF-αpromoter Luciferase荧光比值升高。F2及Ver对其具有抑制作用，加入外源TNF-α，LPS刺激或转染P65质粒，可对抗F2及Ver的作用。 5.无钙液H/R可致NF-κB从细胞质向细胞核转移，F2及Ver对其具有抑制作用。 结论： 1.无钙液刺激可诱发H9C2细胞生成TNF-α。无钙液条件下加入H/R可刺激TNF-α高表达，F2及Ver可抑制无钙液H/R所致TNF-α高表达。 2.F2及Ver可通过TNF-α/NF-κB环路抑制TNF-α的表达可能是其抗H9C2心肌细胞无钙液H/R损伤的一个重要机制。