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目的研究新型布尼亚病毒(SFTSV)所致发热伴血小板减少综合征(SFTS)的流行病学特征,研究SFTS的实验室诊断方法,探讨SFTSV在自然界可能存在的动物宿主及传播媒介,为发热伴血小板减少综合征的预防和控制提供科学依据。方法1.SFTS病人实验室诊断、临床特征及其流行病学特征研究2011年6月至2011年11月,从山东省沂源县医院、中医院获得24例SFTS疑似病人急性期血清,并在3个月后采集其恢复期血清,记录病人基本资料、临床信息和实验室检查结果。提取疑似病人急性期血清RNA,自行设计三对引物(LCYY/L、MCYY/M、 SCYY/S)用巢式RT-PCR方法分别扩增血清中SFTSV RNA的L、M和S片段,将自行设计的三对引物与参考文献的三对引物(LW/LN、 MWMN、SW/SN)的扩增结果进行比较,计算不同引物扩增的检出率。基因克隆后进行DNA测序,同时ELISA方法检测病人急性期和恢复期血清SFTSV总抗体。根据国家卫生部颁布《发热伴血小板减少综合征防治指南(2010版)》的诊断标准,进行SFTS病例确诊。研究SFTS确诊病人的流行病学特征和临床特征,以及SFTSV RNA检出率与病人血清采集时间的关系。2.健康人群血清中SFTSV血清流行病学调查采用问卷方式在山东省沂源县SFTS发病率较高的乡镇进行流行病学调查,同时采集健康人血清。采用ELISA方法检测健康人血清中SFTSV总抗体,计算健康人群中SFTSV抗体阳性率。3.羊血清SFTSV抗体、RNA检测及病毒分离2011年6月在山东省沂源县SFTS发病率较高的乡镇采集放养羊血清,ELISA方法检测羊血清中SFTSV总抗体,计算羊血清中SFTSV抗体阳性率。将抗体检测阴性的羊血清提取RNA,RT-PCR检测血清中SFTSV RNA,同时将血清接种DH82细胞,进行SFTSV分离培养,盲传3代后,RT-PCR检测SFTSV RNA。4.蜱、蜱卵体内SFTSV RNA检测及病毒分离培养采用布旗法在SFTS流行地区草地采集游离蜱成虫和若虫,采用宿主动物体表逆毛捡拾法,从羊体表采集寄生蜱,按照地区、数量各自分装并进行形态学分类鉴定；部分吸血蜱带回实验室内产卵。提取RNA, RT-PCR检测蜱及蜱卵中SFTSV RNA;蜱及蜱卵用无菌生理盐水清洗后,研磨,离心,上清接种DH82细胞,盲传3代后,RT-PCR检测SFTSV RNA。5.野鼠体内SFTSV RNA及抗体的检测2011年6月～2012年11月期间,在野外自然环境中采用夹(笼)夜法捕捉野鼠。每次获取死鼠后,鉴定其种属、性别,解剖取脾脏,洁净滤纸吸取鼠心脏血。将鼠脾脏在冰上研磨,提取RNA后RT-PCR扩增SFTSV RNA,并进行序列测定,吸血的滤纸用PBS清洗后,ELISA检测鼠血SFTSV总抗体。结果1.SFTS实验室诊断24份疑似病例中,12例SFTSV RNA阳性,阳性率为50.0%(12/24),不同引物RT-PCR扩增SFTS病人血清中SFTSV RNA的L,M,S不同片段的检出率不同,从生物学意义上看,S片段检出率最高,其次是L片段,未扩出M片段。而且SCYY-F1/R1、S-F2/R2引物扩增的阳性病例包括了其他引物扩增的所有阳性病例,急性期血清中病毒RNA的检出率,7天内为64.5%,8～14天为37.5%,二者差异无统计学意义(P>0.05)；13例病人急性期血清SFTSV抗体阳性,阳性率为54.2%(13/24)；21例恢复期血清中,18例SFTSV抗体阳性,阳性率为85.7%(18/21)。根据SFTSV RNA及总抗体检测结果,确诊病人22例,表明发热伴血小板减少病例中,91.7%的病例是SFTSV感染。2. SFTS病人临床特征及其流行病学特征临床主要表现为发热和消化道症状,100%病人均有发热症状,血常规检测出现血小板减少和(或)白细胞减少。22例SFTS确诊病人发病时间集中在5月～10月份,8月份达高峰。年龄在40-80岁,男性14名,女性8名,不同年龄组间性别无显著性差异。职业均是农民,90.9%确诊病人饲养家畜,27.3%确诊病人有明确蜱咬史。3.本次调查了237名健康人群,年龄分布在20-89岁,年龄中位数54岁,男女比例为1：1.6,不同年龄组间性别分布无显著性差异,职业均是农民,79.3%饲养家畜,均无明确蜱咬史。237份健康人血清中,2份抗体阳性,SFTSV,总抗体阳性率为0.8%(2/237),效价>1：128。4.188份羊血清中,161份SFTSV抗体阳性,阳性率为85.6%(161/188),血清效价为1：32-1：1024。27份SFTSV抗体阴性羊血清中SFTSV核酸检测均为阴性,DH82细胞分离培养未分离到SFTSV。5.本次采集蜱均为长角血蜱,草地里共采集游离蜱成虫450只,未检测到SFTSV RNA;2000只蜱若虫SFTSV核酸检测结果均为阴性。羊体表采集的517只吸血蜱,492只羊吸血蜱中1只核酸检测阳性,阳性率为0.20%(1/492)。25份吸血蜱产的卵中,SFTSV核酸检测结果均为阴性,DH82细胞分离培养未分离到SFTSV.6.本研究共获得93份野鼠,其中：黑线姬鼠59只,仓鼠3只,黄胸鼠17只,褐家鼠11只,3只鼩鼱。鼠脾脏中SFTSV核酸检测结果均为阴性,鼠血清SFTSV抗体均为阴性。结论1.山东省沂源县健康人群中存在SFTSV感染。在SFTS流行季节,在SFTS流行地区,临床上出现发热伴血小板减少和(或)白细胞减少病例时要首先考虑SFTSV感染,及时采取抗病毒治疗。2.PCR检测山东省沂源县SFTS病人血清中SFTSV RNA时,可优先选择SCYY/S引物。3.羊可能是SFTSV的动物宿主,蜱可能通过吸血感染SFTSV,尚不能确定SFTSV可以经蜱垂直传播,未发现鼠感染和携带SFTSV。