【摘 要】
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目的本实验以shRNA为工具,构建针对人PIAS-1目的基因的慢病毒载体(pLKO.1),拟以病毒为载体沉默宫颈癌细胞株中的PIAS-1,用于研究PIAS-1的表达与宫颈癌的相关性及对肿瘤的作用
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目的本实验以shRNA为工具,构建针对人PIAS-1目的基因的慢病毒载体(pLKO.1),拟以病毒为载体沉默宫颈癌细胞株中的PIAS-1,用于研究PIAS-1的表达与宫颈癌的相关性及对肿瘤的作用。方法以GenBank中PIAS-1的基因序列,根据siRNA设计原则,以及pLKO.1载体特点,设计上下游引物,并由公司合成,然后退火形成shRNA Oligos。扩增pLKO.1质粒,并使用内切酶双酶切并胶回收pLKO.1,用纯化试剂盒纯化双酶切后的质粒产物,后用连接酶将shRNA Oligos插入酶切后的质粒中,然后将重组质粒转化至感受态细胞E. coli DH5α大肠杆菌,选取阳性克隆扩菌后提取PIAS-1-pLKO.1-puro重组质粒进行双酶切及PCR鉴定,保存含有重组质粒的菌液并送含有PIAS-1-pLKO.1-puro的重组质粒的E. coli DH5α大肠杆菌菌液到测序公司测序。结果按照质粒小量提取试剂盒操作说明提取pLKO.1质粒,在凝胶电泳中出现目的条带。用Age Ⅰ及EcoR Ⅰ双酶切胶回收后的质粒,在凝胶电泳中出现明显的两条带。根据GenBank中的PIAS-1基因序列设计的上下游引物,然后以重组质粒为模版,PCR验证重组质粒,在凝胶电泳中大小约7000bp处出现目的条带。重组慢病毒载体PIAS-1-pLKO.1-puro测序结果与GenBank上的序列完全一致,克隆的目的片段已经正确插入到慢病毒载体结论成功构建了针对PIAS-1目的基因的慢病毒载体,为下一步研究PIAS-1的表达对肿瘤的作用以及与宫颈癌的相关性做好准备。
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