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分析2009年大流行H1N1流感病毒(H1N1/2009)和季节性H1N1流感病毒的HA基因片段发现,几乎所有的人季节性H1N1流感毒株HA上142和177位点都有糖基化,而在H1N1/2009流感毒株中这两个位点都没有糖基化。为了探究H1N1/009流感病毒引入这两个糖基化位点后对小鼠毒力和致病性的影响,本研究使A/Mexico/4486/2009(HlN1)这株病毒获得这两个糖基化位点,研究突变毒株的抗原性变化和致病性的差异,以期发现糖基化对病毒致病机制的调控。目前在世界范围内流行的猪流感主要包括三种亚型：H1N1、H3N2、H1N2,包括古典H1N1猪流感,类禽H1N1猪流感,类人H3N2猪流感,重组H3N2和其他多种重组型的H1N2猪流感。中国报道的20株H1N2猪流感病毒目前仍没有详细的基因型和重组特征分析,为此根据流感病毒库中的序列对比,本文将H1N2猪流感病毒进行具体分型,并且利用2009年本实验室在湖北某猪场分离到的两株H1N2猪流感病毒进行小鼠致病性研究,为H1N2猪流感的防控奠定基础。主要研究内容如下：1甲型H1N1流感病毒糖基化位点的改变对其毒力和致病性的研究利用定点突变和反向遗传操作技术使A/Mexico/4486/2009(H1N1)病毒获得142和177这两个糖基化位点,构建三个突变毒株H1N1/144、H1N1/177和H1N1/144+177,分别具有142、177和142+177糖基化位点。与野生型H1N1/2009毒株(H1N1/WT)对比研究发现：(1)糖基化位点的引入使得病毒HA抗原特异性及其对受体的亲和能力发生改变,单抗对具有142糖基化位点的突变毒株中和能力下降,且糖基化位点突变毒株从红细胞上洗脱时间延长。(2)体外生物学特性研究显示,H1N1/144突变株在鸡胚上增殖能力最强,H1N1/144+177次之,H1N1/177和H1N1/WT差异不显著。H1N1/144+177的毒力最强,三个突变毒株毒力都要强于野生型毒株。(3)对小鼠的致病性方面,H1N1/144在小鼠肺脏病毒滴度最高,H1N1/144+177其次,H1N1/177与H1N1/WT差异不显著。三个糖基化毒株对小鼠毒力比野生型毒株强,但这四个毒株都不致死小鼠。引入糖基化位点毒株可引起小鼠肺脏多种炎性因子早期显著上调表达,与H1N1/WT相比,H1N1/177和H1N1/144+177可诱导IL-1β显著上调,H1N1/144+177可诱导MCP-1、TNF-α IFN-γ显著上调,H1N1/144和H1N1/177诱导IL-10显著上调。突变毒株感染小鼠后肺脏出现典型的流感病毒感染损伤,包括毛细支气管炎、上皮细胞脱落坏死和肺泡炎,其中突变毒株引起的肺脏损伤比野生型严重,尤以H1N1/144+177导致的肺脏损伤最为严重。2H1N2猪流感病毒基因型分析及其对小鼠的致病性和炎性反应(1)本研究对A/swine/Hubei/04/2009(HB/04)和A/swine/Hubei/05/2009(HB/05)这两株病毒以及2004-2010年在中国报道的其他18株H1N2猪流感病毒进行基因型分析发现,这20株H1N2猪流感病毒可分为6种不同的基因型：2个重组型来源于三源重组H3N2和古典H1N1猪流感病毒,3个重组型来源于三源重组H1N2、欧亚类禽H1N1和H9N2猪流感病毒,1个重组型来源于人H1N1、人H3N2和古典H1Nl流感病毒。三源重组H1N2猪流感病毒是主要的基因型,本实验室分离到的也属于此类型。(2)体外生物学特性研究发现,HB/04和HB/05的EID50分别为10-6.4/200μL和10-5.2/200μL。HB/04和HB/05都可达到较高血凝价,HB/05的血凝价为211,比HB/04的29高。HB/04和HB/05的鸡胚平均死亡时间(MDT)分别为76.8h和72h。TCID50都为10-7.6/100μL。(3)利用小鼠作为动物模型研究这两株病毒的致病性发现,病毒可在小鼠肺脏有效增殖,第5天可从直肠检测到排毒。HB/04和HB/05感染小鼠后,小鼠的存活率分别为58.3%和75%。HB/04和HB/05引起炎性因子IL-1β、IL-6、 IL-10、IL-12、TNF-α和IFN-γ显著上调。HB/04和HB/05可导致感染小鼠肺脏严重的病理学变化,毛细支气管炎、呼吸道上皮细胞脱落坏死和肺泡炎,感染后第6和9天肺脏损伤最严重。