论文部分内容阅读
目的：通过构建壳聚糖-明胶三维支架，并用三维支架与旋转培养系统(RCCS)形成的三维培养体系(3D)来培养脐血分离的CD34+细胞，观察脐血干细胞向血小板分化的情况。方法：1、冷冻干燥法制备不同浓度配比的壳聚糖-明胶支架，扫描电镜观察支架表面特征，测量支架的孔径大小、并计算孔隙率、吸水率以及相容性测定，选取适合脐血干细胞生长的支架。2、用磁珠分选的方法对人脐血CD34+细胞进行分离鉴定，将脐血CD34+细胞附着在壳聚糖-明胶支架上，放入RCCS系统进行3D培养，倒置显微镜观察细胞形态，扫描电镜观察细胞在支架上的粘附生长状况，MTT法检测细胞活性，流式细胞仪检测细胞标志物，以及对分化所得的血小板进行形态及功能鉴定，并与二维培养体系(2D)进行比较。结果：1、成功构建壳聚糖-明胶支架，选用壳聚糖、明胶各0.5g，预冻温度为-30℃条件下制备支架，孔径为(86±21)μm、吸水率为(87.62±10.19)%、孔隙率为(92.56±1.12)%，细胞相容性好，无毒副作用，适宜脐血干细胞培养用三维支架。2、磁珠分选出脐血CD34+细胞，将细胞以5×104/ml的种植率种植在2D和3D体系中。扫描电镜观察细胞粘附于支架上，生长状况良好；3D培养第8d CD34+细胞可增殖(87.02±4.35)倍，2D培养到第5d达到峰值，细胞可增殖(20.78±5.03)倍，两者间具有统计学意义(P <0.05)；流式检测细胞膜表面标志物CD41+CD61+，培养到第7d、14d，3D体系测得的的结果为((28.70±1.75)、(82.40±2.91))%，2D体系中测得的结果为((27.18±2.63)、(80.33±3.56))%；3D培养系统所得类血小板颗粒较2D多，3D培养系统所得类血小板颗粒细胞数为(31.60±0.74)×106/ml，2D培养条件所得类血小板颗粒细胞数为(7.91±0.93)×106/ml，其黏附率为(43.05±1.93)%，2D为(41.37±1.06)%，两者无统计学意义；两种培养系统所收集的类血小板颗粒在镜下观察都具有聚集能力，流式细胞仪检测类血小板细胞膜有活化后标志物CD62p的表达，阳性率分别为((73.82±1.01)、(75.26±2.57))%，差异不显著，无统计学差异。结论：1、通过冷冻干燥法成功构建了适合脐血干细胞生长的壳聚糖-明胶三维支架。2、壳聚糖-明胶支架和RCCS系统构建的三维培养体系利于脐血干细胞的增殖生长。