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目的:观察线粒体乙醛脱氢酶2对糖尿病心肌损伤中Notch1信号通路的影响,探讨其发挥作用的相关分子机制。方法:腹腔注射链脲佐菌素(55mg/kg)进行糖尿病大鼠模型的复制,分成正常对照组(Con)、糖尿病4W组(DM 4W)、糖尿病8W组(DM 8W)和糖尿病8W+ALDH2激动剂乙醇组(DM+Et OH)。造模成功1周后DM+Et OH组大鼠予以2.5%乙醇日常饮用,1周后改浓度为5%的乙醇,持续8周。测定不同时间点各组小动物超声大鼠心功能;8周后对各组大鼠行在体心肌缺血/再灌注(I/R)模型复制,分为Con8W I/R组、DM 8W I/R、DM+Et OH 8W I/R。测量大鼠体重、心脏重量,计算出心系数;自动生化分析仪测定血浆肌酸激酶(creatine kinase,CK)和肌酸激酶同工酶(creatine kinase isozyme,CK-MB)水平;试剂盒检测大鼠心肌组织细胞色素C(cytochrome C,Cyt C)及TNF-a水平变化;HE染色后光镜下观察大鼠心肌组织及细胞形态;Masson染色及PAS染色观察大鼠心肌纤维化情况;Western Blotting测定心肌组织ALDH2、Notch1、Hes-1及Jagged-1蛋白表达;免疫组织化学法检测大鼠心肌组织ALDH2、Notch1、Hes-1及Jagged-1的蛋白。在动物模型的基础上,取1~3日龄的SD乳鼠的心室肌进行心肌细胞的原代培养,分为正常对照组(N)、正常+ALDH2激动剂Alda-1组(N+Alda-1)、高糖组(HG)、高糖+Alda-1组(HG+Alda-1)、高糖+Alda-1+ALDH2抑制剂Daidzin组(HG+Alda-1+Daidzin)、高糖+Daidzin组(HG+Daidzin),高糖+Alda-1+Notch1抑制剂DAPT组(HG+Alda-1+DAPT);在心肌细胞原代培养的基础上,对细胞进行缺氧复氧处理模拟心肌缺血再灌注损伤过程。免疫荧光鉴定心肌细胞;CCK-8法检测各组心肌细胞活力;采用Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒通过流式细胞仪技术检测各组心肌细胞的凋亡情况;Western Blotting检测各组心肌细胞ALDH2、Notch1、Hes-1、Jagged-1表达。结果:(1)大鼠一般情况:与Con组相比,DM组进食量增加,体型消瘦,体重下降,精神萎靡,尿量增加,活动迟缓,体毛无光泽等表现,病程越长,表现越明显;DM+Et OH组以上各种情况得到不同程度的改善;(2)心系数:与Con组相比,DM及DM+Et OH组大鼠体重、心脏重量显著减少,心系数明显增加(P<0.01);在糖尿病不同病程中,DM 8W组较DM 4W组心脏重量增加(P<0.05),心系数继续增加(P<0.01);与DM 8W组相比,DM+Et OH组心脏重量明显减轻(P<0.05),心系数显著降低(P<0.01)。(3)左室心功能指标:与Con组相比,DM 4W组和DM 8W组LVIDd、LVIDs增加明显(P<0.01),EF%及FS%降低明显,心功能降低;随着糖尿病的进展,DM 8W组LVIDd、LVIDs较DM 4W组进一步增加(P<0.01),EF%及FS%进一步降低,心功能进一步下降(P<0.01);与DM 8W组相比,DM+Et OH组LVIDd、LVIDs明显减低(P<0.01),EF%及FS%明显升高,心功能改善。(4)各组大鼠血清CK、CK-MB水平:与Con组相比,DM4W及DM 8W组CK、CK-MB水平明显升高(P<0.01);与DM 4W相比,DM 8W组CK、CK-MB水平进一步升高(P<0.01);与DM 8W组相比,DM+Et OH组CK、CK-MB水平明显降低(P<0.01)。(5)ELISA检测大鼠心肌组织中Cyt C及TNF-a水平变化:与Con组相比,DM 4W及DM8W组Cyt C、TNF-a表达明显升高(P<0.01);与DM4W相比,DM 8W组Cyt C、TNF-a水平进一步升高(P<0.01);与DM 8W组相比,DM+Et OH组Cyt C、TNF-a水平明显降低(P<0.01)。(6)HE染色后光镜下观察大鼠心肌组织及细胞形态:Con组心肌细胞清晰,排列规则,纤维结构清楚,心肌间隙正常,未见炎性细胞浸润;DM 4W组心肌细胞及纤维排列紊乱,心肌细胞肥大,心肌间隙增宽;DM 8W组心肌纤维出现断裂,溶解,心肌细胞肥大、变性和坏死;与DM 8W组相比,DM+Et OH组心肌细胞上述病变减轻。Con I/R组心肌纤维排列模糊,有断裂;DM I/R组心肌细胞肥大,可见变性和坏死,心肌纤维紊乱,心肌间隙增大,有炎性细胞浸润;DM+Et OH I/R组心肌细胞排列较整齐,变性和坏死的程度及范围明显减少。(7)Masson染色及PAS染色观察各组大鼠心肌纤维化情况:与Con组相比,DM4W、DM 8W组胶原纤维含量、PAS阳性物质显著升高;随着病程的延长,DM 8W组较DM 4W组的胶原纤维含量、PAS阳性物质进一步升高;与DM 8W组相比,DM+Et OH组胶原纤维含量、PAS阳性物质显著降低。与Con I/R组相比,DM I/R组胶原纤维含量、PAS阳性物质明显升高;与DM I/R组相比,DM+Et OH I/R组胶原纤维含量、PAS阳性物质显著下降。(8)Western Blotting及免疫组化法测大鼠心肌组织ALDH2、Notch1、Hes-1、Jagged-1表达:与Con组相比,DM4W组、DM 8W组ALDH2、Notch1、Hes-1、Jagged-1表达减少;与DM4W组相比,DM 8W组ALDH2、Notch1、Hes-1、Jagged-1表达进一步减少;与DM 8W组相比,DM+Et OH组ALDH2、Notch1、Hes-1、Jagged-1表达明显增加。(9)心肌细胞活力及细胞凋亡率测定:与N组相比,HG组、HG+Alda-1+Daidzin组及HG+Daidzin组心肌细胞活力下降、细胞凋亡率显著增高(p<0.01);与HG组相比,HG+Alda-1组心肌细胞活力上升、细胞凋亡率显著降低(p<0.01);与HG+Alda-1组相比,HG+Alda-1+Daidzin组、HG+Daidzin组及HG+Alda-1+DAPT组心肌细胞活力下降、细胞凋亡率增高(p<0.01)。与N I/R组相比,N+Alda-1 I/R组细胞活无明显变化,HG I/R组、HG+Alda-1+Daidzin I/R组及HG+Daidzin I/R组细胞活性明显下降(P<0.01);与HG I/R组相比,HG+Alda-1 I/R组细胞活力明显上升(P<0.01);与HG+Alda-1 I/R组相比,HG+Alda-1+Daidzin I/R组、HG+Daidzin I/R组及HG+Alda-1+DAPT I/R组细胞活力显著下降(P<0.01)。(10)Western Blotting测心肌细胞ALDH2、Notch1、Hes-1、Jagged-1表达:与N组相比,HG组及HG+Alda-1+Daidzin组ALDH2、Notch1、Hes-1、Jagged-1表达下降(p<0.01);与HG组相比,HG+Alda-1组ALDH2、Notch1、Hes-1、Jagged-1表达增加(P<0.01);与HG+Alda-1组相比,HG+Alda-1+Daidzin组及HG+Daidzin组ALDH2、Notch1、Hes-1、Jagged-1表达明显降低(P<0.01)结论:1.线粒体ALDH2的表达增强对糖尿病心肌损伤有明显的保护作用,抑制线粒体ALDH2表达后,心肌纤维化程度和细胞凋亡增加,心肌损伤加重。2.线粒体ALDH2可能通过调节Notch1信号通路发挥心肌保护作用,激动ALDH2后可增强Notch1、Hes-1、Jagged-1表达,大鼠心系数降低、心功能增加。3.激动线粒体ALDH2可对糖尿病大鼠缺血/再灌注损伤心肌发挥保护作用,其机制可能与激活Notch1信号通路有关。4.激动线粒体ALDH2可提高心肌细胞活力,改善心肌细胞凋亡;抑制Notch1信号通路后,线粒体ALDH2的表达降低,心肌细胞活力降低,细胞凋亡增加。