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目的：1.研究PI3K/Akt/mTOR信号通路关键信号分子PI3K、AKT、mTOR、P70S6K、PTEN、4EBP基因的mRNA在胃癌组织与癌旁组织表达差异。2.本研究首次将5种永生化胃癌细胞和正常胃粘膜细胞通过体外实验对该通路进行系统研究,检测PI3K/Akt/mTOR信号通路关键信号分子PI3K、AKT、mTOR、 PTEN、4EBP的mRNA在不同分化程度胃癌细胞(低分化胃癌细胞株MGC-803、 BGC-823、中等分化胃癌细胞株SGC-7901、高分化胃癌细胞株MKN-45、MKN-28)与正常胃粘膜细胞GES-1中表达的差异,筛选出PI3K/Akt/mTOR信号通路异常活化胃癌细胞株进行后续实验。3.通过选用关键靶分子抑制剂LY294002和Rapamycin,观察胃癌细胞株和正常胃粘膜细胞株中PI3K/AKT/mTOR信号转导通路活性变化,研究LY294002和Rapamycin对PI3K/Akt/mTOR信号通路关键信号分子mRNA和蛋白表达影响。4.研究关键靶分子抑制剂LY294002和雷帕霉素(Rapamycin)对胃癌细胞及正常胃粘膜细胞增殖、周期、凋亡的影响。方法：1.本研究募集了62例原发性胃癌患者的胃癌组织及癌旁组织,采用实时荧光定量PCR法测得胃癌组织及癌旁组织PI3K、AKT、 mTOR、R70S6K、PTEN、4EBP及内参actin的Ct值,计算△Ct值,△Ct=Ct目的基因-CtActin使用病例组△Ct与对照组△Ct进行配对T检验,比较关键信号分子mRNA在胃癌组织及癌旁中表达的差异。2.采用实时荧光定量PCR法检测5种胃癌细胞(低分化胃癌细胞株MGC-803、 BGC-823、中等分化胃癌细胞株SGC-7901、高分化胃癌细胞株MKN-45、MKN-28)与对照组正常胃粘膜细胞(GES-1)PI3K/Akt/mTOR信号通路关键信号分子PT3K、AKT、 mTOR、P70S6K、PTEN、4EBP的mRNA表达差异。3.分别使用PI3K/Akt/mTOR信号通路关键靶分子抑制剂LY294002和Rapamycin处理胃癌细胞和正常胃粘膜细胞24h、48h,观察胃癌细胞株和正常胃粘膜细胞株中PI3K/AKT/mTOR信号转导通路活性变化,采用实时荧光定量PCR和蛋白印记法,定性和半定量检测抑制剂对PI3K/Akt/mTOR信号通路关键信号分子表达变化。4.研究通路抑制剂LY294002和Rapamycin对胃癌细胞及正常胃粘膜细胞生物学行为的变化,MTT法检测通路抑制剂作用24h、48h对细胞增殖活力的影响,使用PI染色法和Annexin V-FITC/PI双染法检测抑制剂对胃癌细胞及正常胃粘膜细胞周期和凋亡的影响。结果1.PCR结果显示,PI3K、AKT、mTOR、4EBP、PTEN在胃癌组织和癌旁组织△Ct值有显著性差异(P<0.05),癌组织表达量2-△△Ct分别是癌旁组织的2.259倍、4.234倍、2.709倍、2.713倍、0.623倍,P70S6KA Ct值两组间无显著性差异(P>0.05)。2.在P13K基因中,胃癌细胞MGC-803、BGC-823、SGC-7901、MKN28中P13K的mRNA表达量明显高于正常胃粘膜细胞(P<0.05),其2-△△Ct分别是正常胃粘膜细胞的2.468倍、9.388倍、4.148倍、1.842倍；MKN-45该基因mRNA表达量低于GES-1,是对照组的0.372倍(P<0.05)。3.在AKT基因中,胃癌细胞MGC-803的AKT基因mRNA表达量相对于对照组GES-1没有统计学差异(P>0.05),BGC-823、SGC-7901中AKT的mRNA相对表达量明显高于对照组(P<0.05),其2-△△Ct分别是正常胃粘膜细胞的5.870倍,1.268倍。MKN-45、MKN-28的AKT mRNA表达量明显低于对照组GES-1(P<0.05)其2-△△Ct分别是正常胃粘膜细胞的0.259倍、0.309倍。4.在mTOR基因中,胃癌细胞MGC-803、BGC-823、SGC-7901、MKN28中mTOR的mRNA表达量明显高于正常胃粘膜细胞GES-1(P<0.05)其2-△△Ct分别是正常胃粘膜细胞的1.537倍、9.388倍、2.241倍、1.842倍；在MKN-45细胞株中mTOR mRNA相对表达量和对照组差异没有统计学意义(P>0.05)。5.在mTOR通路下游基因P70S6K中,胃癌细胞MKN-28、SGC-7901、BGC-823中P70S6K的mRNA表达量明显高于对照组GES-1 (P<0.05)其2-△△Ct分别是正常胃粘膜细胞的32.323倍、2.142倍、6.638倍,MKN-45、MGC-803的P70S6K mRNA表达量低于对照组(P<0.05)是对照组的0.052倍、0.468倍。6.在mTOR通路下游另一个基因4EBP中,胃癌细胞MGC-803、BGC-823、SGC-7901、中4EBP的mRNA表达量明显高于对照组GES-1(P<0.05),其2-△△Ct分别是正常胃粘膜细胞的5.682倍、8.535倍、5.357倍,高分化细胞株MKN-45.MKN-28的P70S6K mRNA表达量明显低于对照组(P<0.05)分别是对照组的0.094倍、0.122倍。7.在抑癌基因PTEN中,胃癌细胞BGC-823、SGC-7901、MKN-28、MKN-45中PTEN的mRNA表达量明显高于对照组正常胃粘膜细胞GES-1(P<0.05)其2-△△Ct分别是正常胃粘膜细胞的7.539倍、1.687倍、28.840倍、42.224倍,MGC-803的PTEN mRNA表达量低于对照组(P<0.05)是对照组的0.466倍。8.LY294002可抑制胃癌细胞MGC-803、BGC-823、SGC-7901的PI3K/AKT/mTOR信号通路关键信号分子表达,作用24h和48h后,实验组PI3K、AKT、mTOR、4EBP、 P70S6K、PTEN的mRNA表达量与对照组相比均有显著性差异(P<0.05),p-AKT(Ser473)、p-P-70S6K(Thr389)、p-4EBP (Thr37/46)蛋白表达均受到抑制。9. 50μM LY294002可降低胃癌细胞MGC-803、BGC-823、SGC-7901及正常胃粘膜细胞GES-1增殖率,随着浓度升高增殖率逐渐下降。10.50μM LY294002对胃癌细胞MGC-803、BGC-823、SGC-7901及正常胃粘膜细胞GES-1细胞周期均有显著影响。该抑制剂作用于4株细胞48h后,将MGC-803阻滞于S期,实验组S期比例(60.00±4.17)%与对照组(33.70±0.62)%相比有显著性差异(P<0.05)。LY294002将BGC-823阻滞于G1期,实验组G1期比例(63.95±3.75)%与对照组(49.78±0.51)%相比有显著性差异。LY294002缩短SGC-7901 S期进程,实验组S期比例(37.644-1.07)%与对照组(33.81±1.15)%相比有显著性差异。LY294002将GES-1缩短G1期进程,实验组G1期比例(49.26±2.76)%与对照组(64.38±1.78)%相比有显著性差异。11.50pμLY294002促进胃癌细胞MGC-803、BGC-823、SGC-7901及正常胃粘膜细胞GES-1凋亡率的升高。MGC-803、BGC-823、SGC-7901、GES-1细胞对照组凋亡率分别为(3.2±0.4)%、(4.4±1.7)%、(5.3±0.1)%、(5.±±0.4)%,实验组4种细胞凋亡率分别为(55.9±7.0)%、(13.8±1.4)%、(10.2±±0.9)%、(16.6±2.5)%,MGC-803细胞对LY294002更为敏感。12.50nM雷帕霉素作用于MGC-803、BGC-823、SGC-7901细胞48h,实验组PI2K、PTEN、AKT、mTOR、4EBP、P70S6K的mRNA表达量与对照组相比均有显著性差异(P<0.05), p-P70S6K (Thr389)、p-4EBP (Thr37/46)蛋白表达均受到抑制。13.50nnm雷帕霉素作用于MGC-803、BGC-823、SGC-790148h对细胞增殖率的影响较为明显,同时实验组MGC-803、BGC-823、SGC-7901细胞周期均阻滞在G1期,仅升高BGC-823细胞凋亡率。正常细胞GES-1雷帕霉素组与对照组相比,增殖、周期、凋亡均无显著影响。结论：1. PI3K/AKT/mTOR信号转导通路在胃癌病人中存在异常激活现象。2.低分化胃癌细胞株MGC-803、BGC-823、中等分化胃癌细胞株SGC-7901、关键信号分子PI3K、AKT、mTOR、P70S6K、PTEN、4EBP的mRNA与正常胃粘膜细胞GES-1相比显著升高,PI3K/AKT/mTOR信号通路存在异常激活的现象。高分化胃癌细胞MKN-28和MKN-45通路基因AKT、mTOR、P70S6K、4EBP的mRNA低于正常胃粘膜GES-1。3.LY294002可抑制胃癌细胞MGC-803、BGC-823、SGC-7901及正常胃粘膜细胞GES-1信号转导通路关键信号分子,可降低细胞增殖率、改变细胞周期比例、提高细胞凋亡率。4.雷帕霉素对胃癌细胞PI3K/AKT/mTOR信号通路存在抑制作用。雷帕霉素可降低胃癌细胞MGC-803、BGC-823、SGC-7901增殖率,将细胞周期阻滞于G1期,可促进BGC-823细胞凋亡。雷帕霉素对GES-1细胞增殖、周期凋亡无显著影响。雷帕霉素对胃癌的治疗有重要的意义。