论文部分内容阅读
目的： 糖基化是普遍而且重要的一种蛋白质翻译后修饰的过程，由糖基转移酶这一大家族完成。N-乙酰氨基半乳糖转移酶(ppGalNAc-T)则是催化O-糖基化起始的糖基转移酶家族，并与肿瘤等疾病相关。本实验主要通过构建GALNT6低表达和高表达细胞株来探讨N-乙酰氨基半乳糖转移酶6对乳腺癌细胞株MCF-7生物学功能的影响，为发现乳腺癌新的诊断治疗方法和药物靶点提供理论依据。 方法： (1)用脂质体把N-乙酰氨基半乳糖转移酶6的RNA干扰质粒载体和对照载体及真核正义表达载体转入乳腺癌细胞株MCF-7，经过抗性筛选(G418)，构建GALNT6低表达和高表达的MCF-7稳定细胞株。 (2)普通PCR检测目的基因mRNA表达和WB检测目的蛋白表达的变化表明载体成功转入并得到稳定细胞株。 (3) CCK-8法检测细胞增殖能力，划痕实验检测细胞迁移能力的变化 (4)聚合酶链式反应和Western blotting实验检测细胞MMP2、MMP9及其抑制剂TIMP2、TIMP1的mRNA水平和蛋白水平表达量的改变。 (5)聚合酶链式反应和Western blotting实验检测细胞粘蛋白1、E钙粘蛋白及β连环蛋白的基因和蛋白水平表达情况的变化。 (6) Flow Cytometry(FCM流式细胞术)检测细胞凋亡、Western blotting实验检测细胞抗凋亡蛋白Bcl-2的表达变化来观察GALNT6对细胞凋亡的影响。 结果： 聚合酶链式反应和Western blotting对目的基因和蛋白的检测表明相关质粒载体已成功转入乳腺癌细胞MCF-7并得到稳定表达的细胞株;CCK-8和划痕修复实验结果显示GALNT6低表达细胞的增殖能力和迁移能力均有所降低，GALNT6高表达细胞则相反;MMP2和MMP9在GALNT6低表细胞中的表达都有降低，抑制剂TIMP2升高，GALNT6高表达细胞则相反，而TIMP1在低表达和高表达细胞中均无明显变化;GALNT6表达下调的细胞中粘蛋白1的表达降低、E钙粘蛋白表达升高，GALNT6高表达细胞则相反，β连环蛋白在两种细胞中无显著性变化;凋亡能力在GALNT6低表和高表细胞中均无明显变化。 结论: 本实验成功构建GALNT6低表达细胞株（高表达作为补充）;CCK-8实验结果显示GALNT6有促进肿瘤细胞增殖的作用;划痕实验表明GALNT6的表达上调有助于肿瘤细胞MCF-7的迁移;抑制GALNT6的表达可以有效地抑制肿瘤细胞的侵袭;流式细胞术和抗凋亡蛋白Bcl-2表达的检测结果表明GALNT6对肿瘤细胞的凋亡能力没有明显作用。综合所有实验结果可知，N-乙酰氨基半乳糖转移酶6的表达下调可以抑制乳腺癌细胞MCF-7细胞的增殖、迁移、侵袭和粘附能力，但对细胞凋亡无明显作用，由此可以推测N-乙酰氨基半乳糖转移酶6可能对乳腺癌细胞MCF-7的生物学功能有一定影响，在乳腺癌的发生发展中起一定的作用。