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[背景]肠道的辐射敏感性高,是电离辐射损伤的重要靶组织,发生辐射损伤后主要表现为急慢性放射性肠炎。核爆炸与核事故等突发事件中、临床腹盆腔放射治疗中,受照者的肠道组织往往难于幸免。然而,放射性肠损伤存在着损伤靶点多样化、发病机制不明确等难点问题,且临床尚缺乏有效的干预手段。阿魏酸是一种能够促进辐射损伤造血祖细胞增殖、修复血管内皮细胞氧化和炎症损伤、抑制热应激肠道炎症反应的药物,但其对放射性肠损伤的作用与机制尚待分析。因此,本研究将深入研究放射性肠损伤的发病机制,确定阿魏酸干预放射性肠损伤的作用,并探讨放射性肠损伤中关键致炎分子HMGB1在阿魏酸干预放射性肠损伤的作用机制。[目的]通过体内、外实验确定阿魏酸干预放射性肠损伤的作用,综合应用生物信息学技术和现代生物学方法探寻阿魏酸干预放射性肠损伤的生物靶分子和效应细胞,解析阿魏酸调节HMGB1干预放射性肠损伤的作用机制。课题旨在为阿魏酸调节HMGB1干预放射性肠损伤的作用与机制研究提供科学的实验依据,为放射性肠损伤防治提供新的潜力药物。[方法]1.雄性ICR小鼠,6周龄,分为正常对照组、照射模型组、阳性药(408片100mg/kg)对照组,阿魏酸10mg/kg、30mg/kg、90mg/kg(低、中、高剂量)干预组。建立5.5 Gy 60Co 丫射线单次全身照射所致的ICR小鼠急性放射病模型,通过外周血象检查,确定阿魏酸抗辐射的最佳给药方案。通过造血祖细胞集落培养、胸骨骨髓嗜多染红细胞微核细胞率检查、股骨骨髓细胞周期和凋亡检测、骨髓抗辐射蛋白Thbd相对表达量的Western Blot检测,分析阿魏酸对受照小鼠骨髓造血功能的影响。通过ELISA法检测小鼠血清中HMGB1、IL-6等炎症因子含量,分析阿魏酸对受照小鼠炎症反应的影响。制作小鼠小肠石蜡切片,通过H&E染色观察小肠组织病理学改变,通过CD31免疫组化检测肠绒毛内血管内皮细胞密度的改变,分析阿魏酸干预放射性肠损伤的作用。通过UCSF Chimera分子建模系统,对阿魏酸和HMGB1蛋白进行分子拟合,分析二者结合位点,并将其结合位点与HMGB1阳性抑制剂的结合位点对比,预测阿魏酸对HMGB1的调节作用。免疫荧光检测小鼠小肠组织中HMGB1的表达、转移和分布,初步验证分子拟合的预测结果。2.采用60Co γ射线4～16 Gy照射正常人血管内皮细胞HUVEC,2～20 Gy照射正常人小肠粘膜上皮细胞HIEC-6,CCK-8法检测照射后1～10天HUVEC和HIEC-6细胞数的改变,分析两种细胞的辐射敏感性。CCK-8法分析阿魏酸对4 Gy照射后5天HUVEC和HIEC-6细胞活力的影响,分析阿魏酸干预放射性肠损伤的效应细胞,并初步确定阿魏酸防治效应细胞辐射损伤的有效剂量。通过单克隆计数,Metrigel培养,细胞周期检测,HMGB1、IL-6、IL-8、TNFα的ELISA检测,HMGB1、RAGE、TLR2、Thbd的Western Blot检测、HMGB1 的免疫荧光标记,分析5、50、500 nM阿魏酸对HUVEC辐射损伤的防护作用与机制。构建Thbd启动子分泌型荧光素酶载体,双报告基因法检测阿魏酸对Thbd启动子的激活作用。[结果]1.照射前预防性给药4次(间隔24 h),末次预防给药后1h照射,照射后24 h开始治疗性给药3次(间隔24 h),以上预防+治疗累计给药7天的阿魏酸给药方案最有利于提高5.5 Gy照后7天的ICR小鼠外周血白细胞和血小板数。在此给药方案下,随着干预剂量的增加,阿魏酸对5.5 Gy照后7天的ICR小鼠急性放射病的防治作用增强。其中,90mg/kg的阿魏酸抗辐射效果最为显著,与照射模型组比较,它能够使骨髓造血祖细胞(CFU-E、BFU-E、CFU-GM)增加1倍、使骨髓嗜多染红细胞微核细胞率减低一半、使骨髓凋亡细胞百分率和G2/M周期阻滞细胞百分率降低,同时它还能够增加骨髓中抗辐射蛋白Thbd的相对表达量,进而促进受照ICR小鼠骨髓造血功能修复;另外,90 mg/kg的阿魏酸可以通过降低血清炎症因子HMGB1和IL-6,缓解炎症反应;最重要的是,与照射模型组比较,给予30 mg/kg和90 mg/kg阿魏酸的小鼠,其小肠绒毛高度、组织结构、血管内皮细胞密度均得到显著修复。分子拟合发现阿魏酸在HMGB1蛋白上的结合位点为A盒结构域中相邻的甲硫氨酸和丝氨酸,与阳性抑制剂(丙酮酸乙酯和Thbd蛋白)在HMGB1蛋白上的结合位点完全一致,据此预测阿魏酸能够抑制HMGB1的分泌,缓解炎症反应。阿魏酸对受照小鼠小肠细胞中HMGB1表达的影响,初步验证了这一推测。2.HUVEC较HIEC-6对6()Co 丫射线更为敏感,8 Gy 60Co 丫射线照射后,HUVEC细胞数在照后2天一过性升高之后快速降低,照后第10天HUVEC细胞数降低为0,细胞己完全丧失增殖能力,而HIEC-6细胞数于照后4～6天降至最低,之后开始增加,照射后第10天细胞活力恢复为正常对照组的15%。4 Gy 60Coo丫射线照射后5天,与正常对照组比较,HUVEC细胞活力约降低65%,500 nM的阿魏酸可将受照细胞活力提高约13%,而5 nM～500 μM的阿魏酸对正常和4 Gy照射后5天的HIEC-6的细胞活力均无影响,因此认为阿魏酸干预放射性肠损伤的效应细胞为血管内皮细胞。4 Gy照射后,细胞核内HMGB1相对表达量随照后时间延长而降低,细胞质内HMGB1的相对表达量略有升高,同时培养液中HMGB1含量在照后2～5天急剧增加(P<0.05),加重HUVEC辐射损伤。阿魏酸可以促进4 Gy 6(0Co 丫射线照射后5天HMGB1由核外返回细胞核内,使得细胞核中HMGB1表达量升高,细胞培养液中HMGB1含量降低,这一作用随阿魏酸干预剂量增加而增强,尤其500 nM的阿魏酸可使受照HUVEC细胞核中HMGB1表达量和荧光强度恢复至正常细胞水平。同时,随着HMGB1返回细胞核内,位于HUVEC细胞膜上的HMGB1致炎信号受体RAGE和TLR2表达量降低,培养液中炎症因子IL-6、IL-8含量降低,减轻4Gy60CoY射线照射所致炎症反应。500 nM的阿魏酸还可以有效调节4 Gy60Co Y射线照射后5天HUVEC的细胞周期进程,促进G2/M期阻滞细胞进入细胞周期,提高G1期细胞百分比(尸<0.05),提高受照HUVEC的克隆形成率和管腔形成能力,缓解HUVEC辐射损伤。同时,阿魏酸能够通过激活Thbd启动子增加HMGB1内源性抑制蛋白Thbd的表达及活性。[结论]阿魏酸干预放射性肠损伤的主要效应细胞为血管内皮细胞。阿魏酸既可以通过激活Thbd启动子,上调HMGB1内源性抑制蛋白Thbd的表达,调节HMGB1的转移和分泌,又可能直接与HMGB1蛋白结合,抑制HMGB1转移和分泌,减轻炎症反应,进而保护肠道内的血管内皮细胞,减少肠道出血和缺血性炎症,缓解放射性肠损伤。同时,阿魏酸还可以通过缓解骨髓细胞损伤、改善造血功能,进而多系统发挥抗辐射作用。因此,阿魏酸可能成为一种有潜力的放射性肠损伤防治药物。