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第一部分、AK3基因在细胞中的过表达分析 目的：为了研究AK3蛋白的生物学功能,构建重组质粒pcDNA3.1-AK3-FLAG并将其转染到细胞中,通过间接免疫荧光法、免疫共沉淀反应来观察在哺乳动物细胞内AK3蛋白和Sedlin蛋白的表达以及定位情况,验证二者之间是否存在相互作用,并利用GST pulldown实验研究AK3蛋白和Sedlin蛋白在体外是否存在相互作用。 方法：设计AK3的上下游引物,以AK3的全长cDNA序列为模板,PCR扩增出AK3序列,将其构建到pcDNA3.1真核表达载体中,将酶切鉴定正确的pcDNA3.1-AK3-FLAG重组质粒送到上海生工公司测序,经BLAST比对,将测序正确的质粒转染到COS7细胞,观察AK3在COS7细胞内的空间分布,再与Sedlin共同转染到COS7细胞,观察AK3与Sedlin蛋白在细胞内的共定位情况,单独转染pcDNA3.1-AK3-FLAG到HEK293T细胞,再与pCDGFP-Sedlin共同转染到293T细胞,用免疫共沉淀验证两者是否存在相互作用。GST-Sedlin转化到BL21感受态细胞中,成功制备融合蛋白,同时转染 pcDNA3.1-AK3-FLAG到293T细胞通过GST pulldown技术检测两者在体外相互作用情况。 结果：酶切鉴定与公司测序的结果表明重组质粒pcDNA3.1-AK3-FLAG构建成功。荧光显微镜检测AK3在细胞质中呈现点状分布,在细胞核中无明显分布。而Sedlin在细胞核及细胞质中均有分布,二者在COS7细胞中不存在共定位现象。免疫共沉淀实验证明带FLAG标签的AK3蛋白并不能够把带GFP标签的Sedlin蛋白沉淀下来,而在适当浓度IPTG诱导下,GST-Sedlin融合蛋白表达成功,GST pulldown实验验证了体外条件下AK3蛋白并没有和Sedlin蛋白相互作用。 结论：通过免疫荧光实验,结果说明了AK3蛋白和Sedlin蛋白在细胞中不存在共定位现象,而免疫共沉淀和GST pulldown实验证明了AK3蛋白和Sedlin蛋白在体外和细胞内都不存在相互作用。 第二部分、Sedlin点突变体与EBI3相互作用的初步研究 目的：为了研究Sedlin点突变体与EBI3之间的相互作用,构建pCDGFP-SEDL-D47Y和pCDGFP-SEDL-S73L,并将pCDGFP-SEDL-D47Y,和pCDGFP-SEDL-S73L转染到COS7细胞中观察其在哺乳动物细胞中的定位情况并和野生型的进行比较。再将带GFP标签的Sedlin点突变体分别与带FLAG标签的EBI3蛋白共同转染至COS7细胞中观察共定位的情况。将其共定位的情况与野生型的Sedlin与EBI3蛋白的共转情况做比较。 方法：对Sedlin点突变体蛋白全长的编码序列进行PCR扩增。目的片段酶切回收后插入到带GFP标签的载体中,构建表达载体pCDGFP-SEDL-D47Y和pCDGFP-SEDL-S73L,将这两个质粒分别染至COS7细胞,在荧光显微镜下分别观察pCDGFP-SEDL-D47Y和pCDGFP-SEDL-S73L在哺乳动物细胞的定位情况,并比较与野生型的差别。再将pCDGFP-SEDL-D47Y和pCDGFP-SEDL-S73L分别与FLAG-EBI3共同转染至COS7细胞,荧光显微镜下观察比较两组蛋白在细胞内与FLAG-EBI3的共定位情况。 结果：pCDGFP-SEDL-D47Y、pCDGFP-SEDL-S73L真核表达载体经酶切和测序鉴定,各重组质粒均构建正确。免疫荧光显微镜观察Sedlin蛋白的两个点突变体和Flag-EBI3蛋白共同转染至COS7细胞中后的情况,观察结果表明GFP-SEDL-D47Y与FLAG-EBI3的共定位情况与野生型相似,在核内核周都有分布,而SEDL-S73L与EBI3主要共定位于核周。 结论：Sedlin蛋白点突体与EBI3的免疫荧光共定位表明,SEDL-D47Y和EBI3在细胞内存在共定位,且定位情况和野生型相似。而SEDL-S73L和EBI3的共定位主要分布在核周附近。Sedlin蛋白这俩个点突变体与EBI3蛋白在COS7细胞内都存在共定位现象。