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胰岛素调节血糖、脂质及蛋白质代谢，对细胞生存与大脑功能也有重要影响。胰岛β细胞合成胰岛素，在葡萄糖等信号分子刺激下，通过胰岛素分泌小泡向细胞外释放胰岛素，调节生物体相应功能。因β细胞胰岛素分泌功能受损而表现出的胰岛素绝对不足，是糖尿病发病的致命因素之一。胰岛素分泌是一个被蛋白质翻译后修饰高度调控的过程，其中蛋白质磷酸化起非常重要的作用。在最近十几年中，基于质谱的定量磷酸化蛋白质组学飞速发展，使得在系统层面对蛋白质磷酸化动态变化进行研究成为可能。本论文的第一章对定量磷酸化蛋白质组学技术的发展、胰岛和胰岛素分泌小泡及其相关的蛋白质组学研究现状进行了综述。 本论文第一部分工作（第二章）对葡萄糖诱导的胰岛素分泌过程中，胰岛的磷酸化蛋白质组进行了监控，筛选出一批可能与胰岛素分泌相关的磷酸化位点，并对其中3个蛋白质上的4个磷酸化位点（Prkar1a pT75pS77、Tagln2 pS163以及Ndrg1 pS330）在葡萄糖刺激的胰岛素分泌(glucose-stimulated insulin secretion，GSIS)过程中的作用进行了初步生物学功能探索。通常磷酸化蛋白质组学研究对蛋白质样品的需求在毫克级水平，由于胰岛组织的特殊性，从一只大鼠获得的胰岛组织量非常少（微克级），这为研究带来了非常大的困难。这里我们采用了在C8 StageTip里同步进行二氧化钛（titanium dioxide，TiO2）磷酸化肽段富集以及样品除盐，以简化分析流程并减少样品损失。最终一共鉴定到2，487个胰岛蛋白质上的8，539个磷酸化位点，其中6，207个是高可信的一类磷酸化位点。用SILAC（stable isotope labeling by amino acid in cell culture）标记的大鼠β细胞系INS-1E作为内标，在高可信位点中一共定量到了2，877个磷酸化位点，其中有170个胰岛磷酸化位点在30分钟葡萄糖处理下呈现动态变化。这些磷酸化状态受调节的蛋白质主要集中在胰岛素分泌相关途径、细胞骨架动态性、蛋白质在内质网和高尔基体的合成与加工、转录以及翻译过程等。最后，我对170个位点中的Prkarla pT75pS77、Tagln2 pS163以及Ndrg1 pS330在GSIS中的作用进行了初步探索，发现这些位点的确与胰岛素分泌相关。这部分工作首次对胰岛素分泌过程中胰岛磷酸化蛋白质组的动态变化进行了监控，获得了一批潜在与胰岛素分泌相关的磷酸化位点，为进一步的功能研究提供了依据。 本论文第二部分工作（第三章）对大鼠β细胞系INS-1E的胰岛素分泌小泡亚细胞蛋白质组进行了鉴定，并对25分钟至30分钟葡萄糖处理的INS-1E细胞胰岛素分泌小泡组分的蛋白质进行了定量分析。胰岛素分泌小泡作为胰岛素贮存与分泌的载体，在胰岛素分泌过程中起非常重要的作用。但胰岛素分泌小泡占细胞总体积非常小，在胰岛或β细胞水平进行胰岛素分泌相关蛋白质组学研究时，很难获得大量与胰岛素分泌小泡直接相关的信息，以及蛋白质在胰岛素分泌小泡的亚细胞定位信息。单纯的生化分离手段很难获得高纯度的细胞器，这部分工作中我们利用可以有效排除污染蛋白质的protein correlation profiling(PCP)策略，结合tandem mass tags(TMT)标记，对胰岛素分泌小泡蛋白质组进行了更全面以及可靠的鉴定，一共将347个蛋白质定位在胰岛素分泌小泡，并且发现了一系列没有被报道过定位在小泡的蛋白质类别，以及一些新的可能和胰岛素共分泌的蛋白质，包括一些生长因子、免疫相关蛋白质、细胞外基质蛋白质和蛋白质修饰酶等。在25分钟至30分钟葡萄糖刺激后，有18个蛋白质在小泡上的定位发生改变，其中与小泡内pH调节以及胰岛素分泌调节等相关的17个蛋白质在小泡定位均减少。此外，本底状态下还鉴定到500个磷酸化位点的分布模式与小泡标志蛋白质分布模式相同，但本实验中25分钟至30分钟葡萄糖刺激后在小泡组分中尚未检测到小泡磷酸化位点的显著改变。最后对蛋白质以及磷酸化位点分布模式的整合分析发现了一些本底状态下小泡定位可能受磷酸化调节的蛋白质。这部分工作对β细胞胰岛素分泌小泡的蛋白质组提供了更可信更全面的鉴定，发现了一些蛋白质在25分钟至30分钟葡萄糖刺激下小泡定位发生了改变，并且以小泡内pH调节和胰岛素分泌调节相关蛋白质在小泡定位减少为主，而在这个过程中磷酸化位点尚未被检测到在小泡组分显著改变。本章实验的结果对在胰岛素分泌小泡水平理解胰岛素分泌的机制提供了新的思路，也为进一步分子机制的研究提供了一个更可靠更全面的数据集。