论文部分内容阅读
生命细胞中存在着一个精密的骨架系统，保证了细胞正常的形态结构与功能，而微管组织中心(microtubule organizing centre，MTOC)充当着细胞骨架总设计师的角色。不同种属细胞在MTOC的名称上有也有一定的差异。在哺乳动物细胞中，MTOC被称做中心体，它随细胞周期进行复制、分离，并且在分裂期形成纺锤体的两极，是细胞的动力学中心，中心体是一个高度动态变化的结构。每一个中心体均包括两个相互垂直的中心粒(centriole)和中心粒周围物质(pericentriolar material，PCM)。PCM的主要成分是蛋白质，中心蛋白即是其中的一种。游仆虫中心蛋白是由168个氨基酸组成的单肽链酸性蛋白，属于钙离子结合蛋白家族成员。它含有四个螺旋-环-螺旋(helix-loop-helix)结构域，即所谓的EF-hand结构域，每个结构域均可结合一个钙离子。中心蛋白与钙调蛋白具有高度的序列同源性，其三维结构也可能相类似，整个分子呈哑铃型构象，氨基端和羧基端分别为哑铃的两头，各含两个EF手结构域，中间由一段8个氨基酸残基组成的弹性α-螺旋相连。 本研究利用基因重组技术，在已有八肋游仆虫中心蛋白基因的基础上，构建得到了半分子中心蛋白基因(N-EoCen、SC-EoCen、LC-EoCen)的重组表达质粒和带有突变位点G151W的重组质粒。分别为①pGEX-6p-N-EoCen、②pGEX-6p-SC-EoCen、③pGEX-6p-LC-EoCen、④pGEX-6p-M-EoCen(G151W)、⑤pGEX-6p-M-SC-EoCen(G151W)、⑥pGEX-6p-M-LC-EoCen(G151W)。并且将这些重组质粒转入大肠杆菌(E.coli) BL21中，经IPTG诱导获得了中心蛋白的可融性表达，经GST亲和层析、阴离子交换层析和分子筛层析多步纯化得到了纯度较高的蛋白。为游仆虫中心蛋白的化学性质以及生物功能研究准备了必要的材料。 通过圆二色谱和荧光光谱研究了中心蛋白与金属离子(Ca2+、Tb3+)之间的相互作用。研究发现金属离子与中心蛋白结合引起蛋白的二极结构以及高级结构改变。金属离子存在时中心蛋白的疏水性结构域外露，可能蛋白从关闭式状态转变为开放式状态。蛋白的酪氨酸残基与Tb3+之间发生无辐射能量转移而使Tb2+荧光得以敏化和Ca2+竞争Tb3+猝灭该敏化荧光的事实表明Ca2+、Tb3+与中心蛋白的结合位点为同一位点，而且结合顺序一致，即金属离子优先占据C-端结构域的第Ⅳ部位、其次为Ⅲ部位、最后为N端结构域的Ⅰ、Ⅱ部位。由蛋白质结合铽的荧光敏化求得了铽离子与中心蛋白不同金属离子结合部位间的结合常数，分别是:Ka(Ⅳ)=1.23×108 M-1和Ka(Ⅰ、Ⅱ)=2.01×106 M-1。通过钙对铽荧光的竞争性猝灭测得钙与中心蛋白质的结合常数分别为:Ka(Ⅳ)=6.82×105 M-1和Ka(Ⅰ、Ⅱ)=1.13×103 M-1。 以蜂毒素(melittin)作为模拟靶肽，通过圆二色谱、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、紫外光谱、荧光光谱研究了EoCen、N-EoCen、SC-EoCen、LC-EoCen与蜂毒素之间的相互作用。发现只有EoCen和SC-EoCen可以与蜂毒素结合。C端结构域是蛋白与蜂毒素作用的靶位点。Melittin与中心蛋白以一种依赖于金属离子的模式相互作用形成1∶1复合物，其结合常数约为107 M-1。蜂毒素与中心蛋白结合，其分子转动速度变慢，荧光偏振相应增大。金属离子(Ca2+、Tb3+)与蛋白结合引起EoCen溶液构象变化，蛋白疏水性结构域外露，模拟靶肽的色氨酸残基深埋在该疏水性结构内部。同时，melittin由原来的无规则结构转变为一种单螺旋结构。 通过荧光共振光散射、pull-down、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳以及酵母双杂交方法，从体内、体外两个角度研究了游仆虫中心蛋白的聚合特性。研究发现金属离子(Ca2+、Tb3+)在EoCen聚合中起着重要作用。可能结合金属离子的中心蛋白所呈现的构象有利于蛋白形成聚合体。EoCen的聚合不仅仅与蛋白N端的前20几个氨基酸密切相关，蛋白的C端结构域在蛋白聚合过程中也起着一定的作用。与已经报道的人中心蛋白聚合模式不同，游仆虫中心蛋白以一种N端与N端、C端与C端结构域(N-to-N和C-to-C)相互作用的模式形成聚合体。在中心蛋白的聚合中，静电作用力以及疏水性作用力等次级键可能起着重要作用。 在0.1 M Hepes、pH7.4条件下，圆二色谱、荧光光谱表明镁离子对游仆虫中心蛋白二级结构以及高级结构有一定的影响，推测该蛋白除了能与Ca2+结合外，还能与Mg2+结合。Mg2+、Ca2+可以与蛋白高亲和部位竞争性结合，而Mg2+对Ca2+与蛋白低亲和部位的结合影响不大，即蛋白质的高亲和部位(EF-handⅣ)可能是Ca2+/Mg2+混合结合位点。Ca2+与蛋白结合使其疏水结构域外露，而Mg2+与蛋白结合后该疏水结构域更倾向于包结在蛋白内部，可能是由Ca2+/Mg2+与蛋白作用后形成不同的空间结构所致。Mg2+存在条件下，钙离子诱导的蛋白疏水结构域的暴露程度明显减小导致EoCen与模拟靶肽蜂毒素(melittin)之间结合能力的减弱。 中心蛋白可能是稀土离子在有机体内实现其生物效应的主要载体之一，紫外吸收(600 nm)证明稀土离子Lu(Ⅲ)可以促进含有重组质粒pGEX-6p-EoCen大肠杆菌增殖。