论文部分内容阅读
背景：阻断β细胞脂毒性损害始终是防治糖尿病的核心，但迄今缺乏靶向干预药物。我们前期研究发现下调游离脂肪酸受体1（FFAR1）表达将削弱PPARγ激动剂吡格列酮（PIO）拮抗脂毒性β细胞胰岛素分泌受损的作用，推测FFAR1可能参与PIO的抗脂毒性机制。为此，本研究将进一步论证FFAR1是否具有介导PIO保护β细胞脂毒性损坏的作用，并对可能的机制进行探讨，以深入理解这一靶点的价值及其在糖尿病治疗中的潜在作用。目的：（1）观察FFAR1是否参与PIO拮抗β细胞脂毒性凋亡的作用；（2）探讨FFAR1介导PIO拮抗β细胞脂毒性凋亡与氧化应激的关系；（3）研究FFAR1发挥介导效应是否通过PLCγ-ERK1/2-PPARγ信号通路。方法：（1）以对葡萄糖敏感的小鼠胰岛β细胞系（βTC6）作为研究对象，应用RNAi慢病毒载体(siRNA)或FFAR1过表达慢病毒载体(FFAR1+)转染βTC6细胞以调控FFAR1基因表达；1.0mmol/L棕榈酸（PA）干预β细胞24小时，建立脂毒性β细胞模型，不同浓度PIO干预β细胞不同时间段；以观察FFAR1对PIO拮抗β细胞脂毒性凋亡的影响。（2）PIO干预无转染或转染慢病毒（siRNA或FFAR1+）的脂毒性β细胞；同时设置H2O2诱导的β细胞损害作为氧化应激的阳性对照；分析FFAR1介导PIO保护作用与氧化应激的关系。（3）调控FFAR1的表达或运用阻滞剂抑制信号蛋白活性，并以FFAR1的特异激动剂TAK-875干预脂毒性β细胞作为对照，观察FFAR1发挥效应与PLCγ-ERK1/2-PPARγ信号级联的关系。（4）技术手段：流式细胞术和TUNEL检测β细胞的凋亡；RT-PCR检测FFAR1基因的表达；Western blot检测FFAR1，氧化应激相关蛋白（NAPDH氧化酶亚基p47phox，bcl-2，Bax，cleaved caspase3）和信号因子（PLCγ，ERK1/2，PPARγ）的表达；DCFH-DA探针检测细胞内活性氧含量，ELISA检测细胞内IP3水平。结果：（1） PIO可呈浓度和时间依赖性改善脂毒性导致的β细胞凋亡和FFAR1表达抑制；沉默FFAR1表达可减弱PIO改善脂毒性导致的β细胞凋亡，而诱导FFAR1表达，则可增强PIO抗β细胞凋亡的作用；FFAR1表达水平与β细胞凋亡呈负相关。（2）沉默FFAR1表达可减弱PIO对脂毒性诱导的NAPDH氧化酶亚基p47phox，Bax，cleaved caspase3表达和ROS产生的抑制以及对bcl-2表达的上调作用；而诱导FFA1R高表达则可增强PIO上述拮抗氧化应激的作用。同样，这种效应也发生在H2O2诱导的氧化应激上。（3）PIO或TAK-875均可上调脂毒性导致的PLCγ，ERK1/2，PPARγ表达抑制和细胞内IP3水平的下降；而沉默FFAR1表达可削弱PIO上调上述蛋白表达的作用；诱导FFAR1过表达则反之；应用PLCγ，ERK1/2或PPARγ抑制剂可抑制PIO拮抗氧化应激和保护β细胞脂毒性凋亡的作用。结论：FFAR1可通过拮抗氧化应激而介导PIO改善β细胞脂毒性凋亡的作用，这一介导作用与PLCγ-ERK1/2-PPARγ信号通路活化有关。