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背景与目的肺癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,发病率逐年上升,近年来大量新的化疗药物和治疗手段用于中晚期非小细胞肺癌(NSCLC)的治疗,但疗效仍然不佳,中晚期NSCLC的5年生存率小于10%。Cyclin D1是一种原癌基因,在细胞周期G1/S转换、肿瘤细胞的转化及侵袭能力、肿瘤的预后中起重要作用。本实验设计了以Cyclin D1基因为靶标的siRNA干扰载体,观察其对肺腺癌A549细胞体内外增殖和侵袭转移的影响,为进一步应用于肺癌的实验性基因治疗研究提供实验依据。研究方法1.应用免疫组化S-P法检测58例非小细胞肺癌(NSCLC)和15例正常肺组织中Cyclin D1及相关基因NF-?Bp65、P27的表达。2.设计并构建了针对Cyclin D1 mRNA的3条Cyclin D1 siRNA质粒表达载体hCCND11、hCCND12、hCCND13和一条无关对照序列表达载体hK,用脂质体法将hK和hCCND11、hCCND12、hCCND13分别转染人肺腺癌A549细胞,48h后用RT-PCR和Western blot技术检测各实验组A549细胞内Cyclin D1 mRNA及蛋白的表达情况,筛选出有效序列。3.经G418筛选出稳定转染hCCND13表达载体的A549细胞,用Real time PCR和Western blot检测Cyclin D1、MMP-2 mRNA和蛋白表达,免疫荧光检测RhoA、Rac1蛋白的表达,以噻唑蓝(MTT)比色法、流式细胞仪、软琼脂糖克隆形成实验、细胞体外侵袭实验(transwell小室)测定干扰后A549细胞周期、增殖、体外侵袭能力。采用背部皮下种植建立裸鼠移植瘤模型和腹腔内种植建立转移模型,检测各组A549细胞体内生长和转移能力,免疫组化检测肿瘤组织Cyclin D1、MMP-2、RhoA和Rac1蛋白的表达。结果1.NSCLC组织Cyclin D1的过表达率为74.1%(43/58);Cyclin D1的表达与瘤体大小、组织分化、淋巴结转移、临床分期密切相关(P<0.05); NF-?Bp65与Cyclin D1在NSCLC组织中的表达呈正相关(P<0.05),Cyclin D1与P27的表达呈负相关(P<0.05)。2.经酶切鉴定及DNA测序,重组质粒中已插入了目的基因片断。经Real time PCR和Western blot检测,hCCND13能有效抑制Cyclin D1 mRNA及蛋白表达(P<0.01),与空白对照组比较其抑制率分别为61%、52%。3.经G418筛选(800μg/mL)出稳定转染的A549细胞。hCCND13组A549细胞中Cyclin D1 mRNA和蛋白的表达抑制率分别为72%和65%,Cyclin D1蛋白表达降低后MMP-2、RhoA和Rac1蛋白表达也出现下降,A549细胞Cyclin D1表达下降后细胞群体中G0～G1期细胞比例由52.3 %增加至71.7%。并且A549细胞体外增殖抑制率达40%,细胞克隆数(39.0±3.6)相对于空白对照组(82.3±4.9)下降了53%,穿膜细胞数也出现明显下降, hCCND13组减少了62%(P<0.01)。成功建立裸鼠移植瘤模型和转移模型,空白对照组细胞平均成瘤时间为7.3±0.9天,hCCND13组增加为12.1±0.8天,移植瘤体内生长曲线显示hCCND13组的肿瘤生长抑制率达到48%。肺和淋巴结转移率明显下降,hCCND13组移植瘤组织Cyclin D1、MMP-2、RhoA和Rac1蛋白表达明显下降(P<0.05)。结论1. Cyclin D1及其关联基因NF-?B、P27的表达异常共同促进了NSCLC的发生发展,Cyclin D1的过表达促进了NSCLC细胞的增殖和侵袭转移。因此,通过干预Cyclin D1的过表达,有可能抑制NSCLC细胞的增殖和侵袭转移。2.成功构建和鉴定了针对Cyclin D1的RNA干扰表达载体hCCND11、hCCND12、hCCND13,发现hCCND13表达产物能有效抑制Cyclin D1在A549细胞中的表达,为进一步将hCCND13应用于肺癌的实验性基因治疗研究奠定了基础。3. hCCND13表达产物能有效抑制人肺腺癌A549细胞在体内外的增殖、侵袭和淋巴结转移;其抗增殖机制与该表达载体表达产物能特异地干扰A549细胞Cyclin D1的表达,使A549细胞阻滞于G1期,负性调控细胞周期密切相关;其抗侵袭转移机制可能与该表达载体表达产物显著下调MMP-2、Rac1和RhoA的表达密切相关。