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随着生物技术、神经科学的迅速发展,已经发现许多具有中枢治疗活性的多肽蛋白药物,但因血脑屏障的存在,很大程度上限制了这些药物的脑内转运和治疗作用。鼻—脑通路的存在为多肽蛋白药物入脑提供了可能。但这些大分子极性药物本身透粘膜能力差、易受鼻腔中酶的降解和鼻纤毛的清除,因此经鼻入脑的药量仍然很低。本课题组高小玲博士利用鼻腔嗅粘膜和呼吸粘膜糖基表达的差异,设计了一种新型的经鼻给药脑内递释系统—麦胚凝集素修饰聚乙二醇—聚乳酸纳米粒载药系统(WGA-NP),前期药动学、药效学实验已证实,WGA-NP能有效递送多肽药物经鼻入脑。然而,此递药系统经鼻粘膜吸收转运入脑的机理尚不明确。为了安全有效地应用此递药系统,本研究深入系统地考察了WGA-NP在Calu-3细胞吸收的机理及其经鼻给药后入脑的转运通路,并对其细胞毒性进行了评价。本文第一部分为WGA修饰纳米粒的制备和表征。将甲氧基聚乙二醇—聚乳酸(MPEG-PLA)与马来酰亚胺聚乙二醇—聚乳酸(Maleimide-PEG-PLA)经复乳/溶媒蒸发法制备得到纳米粒(NP)。按巯基化的WGA与Male-PEG-PLA投料比为1：25、1：10、1：3、1：1和1：2制备了具有不同WGA修饰密度的WGA-NP。所得纳米粒平均粒径100 nm, Zeta电位-20 mV。随WGA修饰密度增加,其粒径略微增大、Zeta电位略降低。免疫电镜观察证实纳米粒表面连接有凝集素；红细胞凝集实验证实连接于纳米粒表面的凝集素仍具特异性糖基结合活性,且随着WGA修饰密度的增加WGA-NP的凝集活性增强。第二部分为WGA-NP体外细胞摄取及其机理研究。建立了Calu-3细胞模型,光学显微镜和电镜观察证实经过11～14天的培养后,细胞形成单分子层结构,并分化出微绒毛、细胞间紧密连接并分泌粘液；细胞膜上表达N-乙酰氨基葡萄糖。跨膜电阻在300至400Ω·cm2之间,荧光素钠和地塞米松的表观渗透系数分别为2.46×10-7cm/sec和5.99×10-6cm/sec。制备载香豆素-6的WGA-NP/NP用于示踪纳米粒体内外的转运情况。细胞摄取试验证实：(1) WGA-NP在2h内胞吞速度与程度上均显著高于NP; (2) WGA修饰密度对细胞摄取有影响,当WGA与Male-PEG-PLA的摩尔投料比为1：10时,细胞摄取量最高；(3) WGA-NP细胞摄取量随孵育时间、纳米粒浓度的增加而增加,当WGA-NP浓度达4mg/ml后,摄取达饱和；(4)温度显著影响WGA-NP的摄取,表明在细胞摄取的过程中存在递药系统的内化,依赖能量的供给。(5)胞吞抑制实验与胞内细胞器共定位结果显示,各种抑制剂均能不同程度地减少WGA-NP的细胞摄取,说明WGA-NP是通过与Calu-3细胞膜上的N-乙酰氨基葡萄糖特异性结合,介导递药系统的内吞；WGA-NP以能量依赖方式吸收：部分通过细胞膜上的clathrin蛋白构成的包被凹陷或caveolin构成的穴样凹陷(caveolae)介导,也有部分通过巨胞饮途径介导。入胞后,经过各期内体,在高尔基体的参与下,至少部分WGA-NP在胞内转运过程中进入溶酶体,也有部分直接被胞吐或逃脱溶酶体继续转运。第三部分为WGA-NP经鼻入脑转运机理的研究。首先,以近红外染料DiR为荧光探针,评价WGA-NP的脑内递药特性。通过比较WGA-NP和NP不同时间脑部荧光信号分布发现：WGA-NP较NP具有更长的鼻粘膜滞留时间,更好的脑内递药性。通过荧光显微镜定性观察载香豆素-6的WGA-NP不同时间在大鼠鼻粘膜及嗅球的分布。结果显示,WGA-NP能够迅速透过粘膜细胞被吸收,其在鼻腔前部分布相对较少,在鼻腔中后部粘膜丰富的区域以及筛骨筛板分布较多。WGA-NP在嗅粘膜的荧光强度高于呼吸粘膜,其主要通过跨细胞途径吸收,当其通过粘膜上皮细胞或腺体吸收进入粘膜下的固有层时,WGA-NP经神经束或神经束周围结缔组织吸收入脑。采用放射标记技术制备125I-WGA-NP,大鼠鼻腔给药后不同时间点定量测定鼻—脑通路相关组织的放射强度,结果显示,在给药后2h内,WGA-NP主要以完整纳米粒形式入脑。大部分WGA-NP主要通过三叉神经通路从鼻粘膜转运入小脑、桥脑延髓等部分,另有一部分通过嗅上皮通路转运入嗅球,并从嗅球扩散至皮质、纹状体和海马等部分。脑脊液对于WGA-NP的脑转运贡献小。第四部分为WGA-NP细胞毒性评价。通过CCK-8法、乳酸脱氢酶法、谷胱甘肽与活性氧法测定细胞存活率、胞膜损伤及氧化损伤程度,考察不同WGA修饰密度的WGA-NP的细胞毒性。结果显示：随着WGA修饰密度、WGA-NP浓度及孵育时间的增加,毒性有不同程度的增加。药动、药效实验中应用的WGA-NP剂量无明显细胞毒性,是安全可靠的。综合细胞毒性与Calu-3细胞摄取WGA-NP的效率,当WGA与Male-PEG-PLA摩尔比1：10制备得到的WGA毒性较低且摄取效率最高,因此选择1：10为最佳投料比。