水稻逆境相关转录因子OsbZIP71的功能研究

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低温、干旱和高盐等非生物逆境严重地制约了植物的生长发育,影响了作物的产量,在全球自然环境日益恶化的情况下,干旱和盐碱化已经成为许多地区农业生产发展的瓶颈,因而耐逆作物品种特别是耐旱、耐盐品种的培育越来越受到重视。  本论文针对水稻逆境相关转录因子OsbZIP71开展功能研究。在粳稻品种中花11中过表达OsbZIP71基因,对过表达株系进行逆境筛选和农艺性状分析,并初步探讨OsbZIP71基因调控植物抗逆性能和生长发育的机理,以期为该基因在农艺性状改良的应用方面提供一定的理论依据。主要实验结论如下:  1.OsbZIP71的系统进化分析:利用生物学软件ClustalX1.83和MEGA4.0对水稻和拟南芥bZIP家族的Group C和Group S的蛋白序列进行系统进化分析,初步推测OsbZIP71功能与已知基因的相关性。  2.OsbZIP71的转录因子特性分析:  1)构建OsbZIP71-GFP的融合表达载体,通过基因枪法将其转入洋葱表皮细胞中瞬时表达,证明OsbZIP71为核定位蛋白。  2)构建OsbZIP71与pGBKT7的整合表达载体pBD-OsbZIP71,转化酵母菌株AH109,证明OsbZIP71没有转录激活功能。  3)利用酵母单杂交系统,证明OsbZIP71与G-Box元件具有的结合活性。  4)利用酵母双杂系统证明OsbZIP71既能与自身形成同源二聚体也能与所有的Group C的bZIP成员形成异源二聚体,且异源二聚体的活性要比同源二聚体活性强,说明OsbZIP71也许具有多种调控作用。  3.OsbZIP71的诱导表达分析:利用半定量RT-PCR及Realtime PCR方法证明OsbZIP71受甘露醇、蔗糖诱导,不受ABA、干旱、盐、PEG、H2O2、GA和低温诱导。  4.OsbZIP71的生物学功能分析:构建OsbZIP71基因的过表达载体并转入中花11,对转基因水稻进行分子检测,包括PCR检测外源基因是否插入、Southern杂交检测外源基因的拷贝数、半定量RT-PCR和Realtime PCR检测外源基因的表达量等。选取单拷贝株系为研究对象,根据表达量增加倍数可将转基因株系分为表达明显增强的株系(10倍以上)和表达量略有增强株系(2倍左右)。  1) OsbZIP71表达明显增强(10倍以上)的株系:  (1)逆境筛选结果表明过量表达的OsbZIP71能提高水稻苗期对高盐、干旱的耐受能力,且能提高水稻成熟期的耐旱能力。在抽穗灌浆期大田干旱胁迫实验中,过量表达的OsbZIP71的转基因水稻株系产量明显高于非转基因的对照。  (2)对正常条件下生长的过表达OsbZIP71的转基因水稻株系全生育期进行农艺性状调查,发现OsbZIP71基因表达量明显增强的转基因水稻株系与非转基因水稻在农艺性状上没有明显差异。  (3)利用基因芯片和定量RT-PCR技术,对过表达OsbZIP71的转基因水稻幼苗的基因表达谱进行分析和验证,发现逆境相关基因OsNHX1、OsPP15、COR413-TM、 OsCLC-1和HKT6表达有所上调,推测OsbZIP71可能是逆境相关的正调控因子。分析这些逆境相关基因的启动子,发现其均含有G-box元件,结合OsbZIP能够结合G-box元件的结论,推测OsbZIP71可能通过结合下游基因启动子区的G-box顺式作用元件,调节逆境相关的下游基因的表达,从而提高水稻对盐、旱的耐受能力。  2) OsbZIP71表达量略有增强株系(表达量提高1倍)的株系:  (1)对田间正常生长的OsbZIP71表达量略有增强的水稻株系进行全生育期表型调查,发现转基因水稻较野生型中花11的穗变小,二次枝梗数减少,分蘖增加,但株高、一次枝梗数、千粒重和产量不变。  (2)利用基因芯片和Realtime PCR,对过表达OsbZIP71的转基因水稻的幼穗(1cm)的基因表达谱进行分析和验证,结果表明激素相关蛋白OsRR3、LOC_Os11 g44810以及S-like-Rnase(LOC_Os09g36680)蛋白的表达量增强,推测小穗表型可能与这些蛋白有关。  因此,水稻OsbZIP71可能既参与了逆境信号途径的调控,又参与了穗发育的调控,是一个具有多功能的水稻转录因子。对其调控机理的深入研究,将有助于理解水稻的生长发育及逆境相关途径的作用机理。
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