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研究背景
乙型病毒性肝炎是严重危害人类健康的传染病，是肝硬化和肝细胞癌的主要病因。在国家＂九五＂及＂十五＂规划中，均将其列入影响我国国民经济和社会发展的重大疾病。全世界有3.5亿慢性乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus)携带者，我国是乙型肝炎的高发区，乙型肝炎表面抗原(HBsAg)携带率为9.09％，约1亿多人，HBV感染在我国是一个严重的公共卫生问题。
由于HBV基因组是一个双链非闭合的松弛结构，两链的不等长，加上基因长度为3.2Kb，使得全基因组扩增和克隆很难，直到1995年美国学者Gunther成功进行HBV全基因扩增，使得HBV全基因组的体外研究成为可能，但该方法的克隆效率较低，不利于进一步对HBV基因的研究。本研究试图在前人的基础上，建立一种新的更高效的HBV全基因组克隆技术。
研究目的
1．通过引物和酶切位点的设计和载体的合理选择，建立一种HBV全基因组扩增及克隆的新方法，并对该方法的扩增和克隆效率，以及敏感性、保真性等进行分析。
2．将建立的方法对12例患者血清标本进行克隆和测序，并进行生物信息学分析，了解这些患者HBV全基因组的特性。
材料与方法：
本研究所用的HBV感染者血清均来自到中山三院感染科就诊的患者，采集了12例慢性乙型肝炎(CHB)患者追踪9个时段共85份血清。所用的实验试剂根据需要购自不同的生物公司，实验主要在中山三院中心实验室完成。
1．血清HBV DNA滴度测定：85份血清全部进行实时荧光定量PCR法检测，血清HBVDNA滴度以拷贝／毫升表示，实验重复三次，结果取平均值。
2．引物设计、基因扩增和克隆：通过对前人的引物进行分析，合成两对引物，对85份血清进行两片段扩增，成功80份，即进行连接和T-A克隆，鉴定。同时白行设计两对引物，分别对85例血清进行一片段的PCR扩增，各成功29份，然后分别进行T-A克隆、PblueScript SK(-)克隆，和酶切鉴定。比较两种扩增方法的效率和两种克隆方法的效率。
3．一片段法保真性鉴定：对克隆成功的5个样本提取质粒，再次进行扩增和测序，通过扩增前后序列的分析，了解一片段法的保真性。
4．一片段法敏感性分析：提取10份克隆成功的质粒DNA，采用递等稀释法进行稀释，以稀释的质粒DNA为模板，进行一片段扩增，通过分析扩增效率，了解一片段法的敏感性。
5．一片段法实用效果分析：将一片段克隆技术应用到12个患者血清样本上，并进行测序，运用生物信息学的方法对HBV基因进行分析。
结果
1．两种方法扩增的效率：以二片段方法扩增产物进行凝胶电泳，酶切鉴定，可以出现分别为2.05kb和1.15kb的两条带，两条带分子量加起来为3.2kb。一片段方法只能见到一条3.2kb的条带。但一片段方法扩增的成功率低于二片段方法(p<0.05)，且一片段法扩增成功需要的血清HBV DNA浓度高于二片段法(p<0.05)。
2．两种方法的连接和克隆效率：二片段方法要先连接，才能成为全基因组，二片段法80例血清中只有5个样本能成功连接，且重复性差。一片段本身为全基因组，不需要连接。分别用T-A和pBlueStript sk(-)方法进行全基因HBV DNA克隆，T—A克隆效率低，10个白色克隆，仅能得到1个成功插入3.2 Kb的重组质粒，其余是空质粒。SK(-)克隆效率较高，10个白色克隆均能成功插入3.2Kb，克隆效率达90％以上。
3．一片段方法的保真性和敏感性：保真性：对5份血清扩增和PCR产物扩增，比较一、二次产物的序列差异，发现仅有18个碱基不同，总的差异率为1.13bp／kb。且这些差异中没有发现碱基替换，无缺失、插入等现象。横向比较这些差异位点，没有发现相同的差异位点。敏感性：我们的研究发现，大于10<4>的重组质粒DNA可以成功扩增，浓度低于该值的扩增效率很低。
4. 12例血清的基因分析结果：对12例用一片段法成功获得的HBV全基因组DNA序列进行分析，发现C基因型占41.67％(5/12)，B基因型占50％(6/12)，B、C混合基因型占8.33％(1/12)。6例(224，225，226，228，500，502号)血清型为adrq+；6例(227，229，230，23l，233，501号)血清型为adw2。同一血清型不同病毒株之间的序列同源性为97.5％-99.8％。不同血清型病毒株之间的序列同源性为90.6％-99.8％。由于500号为B、C混合型，与其他株的同源性为91.3％-99.8％。
结论
1.血清HBV DNA水平对两种扩增方法的成功率有一定影响，滴度高低是选择合适PCR扩增方法的依据。
2.二片段方法的扩增效率较高，但连接成全基因组比较困难，且克隆效率较低，得到的序列不能反映来自同一个毒株。一片段法不需要连接，克隆效率较高，且保真性和敏感性均较高，但扩增标本中需要较高的HBV DNA滴度。
3.本研究建立的一片段PCR法扩增HBV全基因组及SK-载体克隆的技术平台，可用于HBV DNA滴度较高的样本(最适合大于10<4>拷贝/毫升的样本)的全基因组扩增、克隆和序列分析，为HBV的基础和临床研究提供了一种新方法。