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一、辛伐他汀对急性髓系白血病细胞株增殖的影响目的研究辛伐他汀(Simvastatin,SIM)对急性髓系白血病(Acute Myeloid Leukemia, AML)细胞株NB4、HL-60和SHI-1细胞增殖的影响,并初步探讨其作用机制。方法MTT法及台盼蓝拒染法检测不同浓度SIM作用后NB4、HL-60和SHI-1细胞的增殖水平。Annexin-V抗体检测SIM作用后三种细胞株的凋亡率,并检测了药物作用前后细胞周期分布的变化。Elisa法检测SIM及化疗药物作用后三种细胞株中细胞内胆固醇水平的变化。定量PCR法检测SIM下游羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMG-CoA R)和低密度脂蛋白受体(LDL R)基因在药物作用前后转录本表达水平的变化。结果SIM对NB4、HL-60和SHI-1细胞均有增殖抑制作用,但三细胞株对SIM的敏感性为各不相同,敏感性从高到低依次为NB4>HL60>SHI-1。SIM抑制细胞增殖的机制可能与诱导肿瘤细胞凋亡、细胞周期阻滞以及细胞内胆固醇水平调节相关。SIM可诱导NB4及HL-60细胞凋亡,对SHI-1细胞诱导凋亡的作用较弱。同时还能使细胞周期阻滞于G0/G1期。ELISA法检测SIM及柔红霉素(DNR)、阿糖胞苷(Ara-C)作用后细胞内胆固醇水平发现,SIM能够降低细胞内胆固醇浓度,DNR及Ara-C均使细胞内胆固醇水平迅速上升,但当SIM与化疗药物共同作用后,细胞内胆固醇水平显著降低,对细胞的增殖抑制作用也较化疗药物单独作用时明显增强。定量PCR检测发现SIM作用后HMG-CoA R和LDL R转录本表达水平均明显增加,且呈时间依赖性。结论SIM能够抑制NB4、HL-60和SHI-1等AML细胞增殖,并诱导肿瘤细胞凋亡,使细胞阻滞于G0/G1期。但对具有多药耐药表型的SHI-1细胞,SIM作用相对较弱。细胞内胆固醇水平对AML细胞有保护作用,通过调节细胞内胆固醇水平也能够影响细胞增殖。SIM能够增加细胞对化疗药物的敏感性。二、辛伐他汀对SHI-1细胞多药耐药基因表达水平的影响目的研究SIM对SHI-1细胞多药耐药(MDR1)基因表达的影响。方法台盼蓝拒染法检测SIM处理及无血清培养后SHI-1细胞的增殖水平与细胞活力。FCM检测无血清培养状态下SHI-1细胞多药耐药蛋白(p-gp)表达水平的变化,以及不同浓度SIM对SHI-1细胞p-gp表达水平的影响。定量PCR法检测无血清培养及SIM对MDR-1基因转录本表达水平的影响。采用Elisa法检测了无血清培养后细胞内胆固醇水平的变化,并进一步检测了SIM作用后,SHI-1对化疗药物敏感性的变化。结果SHI-1细胞在无血清培养条件下,细胞生长速度明显低于正常血清培养组,且呈时间依赖性。当在无血清培养条件下,再同时加入SIM处理细胞,对细胞的增殖抑制作用显著增强。无血清培养还能够下调SHI-1细胞p-gp蛋白的表达水平,培养3天后p-gp表达量降至43.6%。SIM对SHI-1细胞的p-gp蛋白表达水平也有抑制作用,呈浓度依赖性。当在无血清培养条件下,同时加用SIM处理细胞,细胞p-gp水平显著下调。定量PCR检测表明,无血清培养及SIM均能够下调MDR1基因mRNA表达水平,联合应用后下调作用更为显著。Elisa法检测细胞内胆固醇水平发现,无血清培养条件下细胞内胆固醇水平较有血清培养组上升,当加入SIM同时作用后,细胞内胆固醇水平则明显下降。对化疗药物敏感性试验则证实,SIM预先作用的SHI-1细胞对柔红霉素更为敏感,细胞死亡率明显高于未处于组。结论SIM及无血清培养能够显著抑制具有多药耐药表型的SHI-1细胞增殖,并能够下调SHI-1细胞p-gp蛋白及MDR1基因转录本的表达水平;在无血清培养条件下同时加入SIM处理细胞时,以上三项抑制作用更为显著。SIM预先处理细胞,能够增加多药耐药细胞对化疗药物的敏感性,增强药物对细胞的增殖抑制作用。三、辛伐他汀对急性髓系白血病CD34+细胞的影响目的初步探讨SIM对AML患者及正常健康志愿者的骨髓CD34+细胞的影响。方法收集AML患者及正常健康志愿者的骨髓5～10ml,采用Ficoll梯度离心方法提取单个核细胞,采用CD34+磁珠分选其中CD34+和CD34-细胞。台盼蓝拒染法观察不同浓度的SIM对两组细胞增殖的影响。定量PCR法检测HMG-CoA R和LDL R转录本在SIM作用前后表达水平的变化。结果共收集15例初治AML患者和8例正常健康志愿者的骨髓,CD34磁珠分选了骨髓单个核细胞中的CD34+和CD34-细胞。不同浓度SIM作用于AML患者及正常志愿者的CD34+细胞24小时后发现,正常CD34+细胞的增殖呈剂量依赖性下降;但AML患者的CD34+细胞对SIM反应表现出了异质性。以正常CD34+细胞对20μM SIM的反应为标准,AML患者CD34+细胞可分为正常反应和异常反应组,对SIM敏感的为正常反应组,对SIM不敏感的为异常反应组。进一步进行药敏试验发现,正常反应组AML患者的CD34+细胞对DNR较为敏感,异常反应组则对DNR敏感性较差。当SIM与DNR共同应用后,细胞的增殖抑制率明显增加。正常反应组和异常反应组AML患者CD34-细胞对SIM反应相似。定量PCR法检测发现,5例正常反应组和4例异常反应组AML患者的CD34+细胞中HMG-CoA R及LDL R的mRNA表达水平均较对照组有明显增加。结论正常健康志愿者CD34+细胞在SIM作用后呈剂量依赖性下降,AML患者CD34+细胞对SIM反应呈异质性,分为正常反应组和异常反应组。SIM能够增加两组细胞对化疗药物的敏感性。SIM作用于两组细胞后,细胞内HMG-CoA R及LDL R的mRNA表达水平均增加。