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植物细胞质雄性不育性(cytoplasmic male sterilit),CMS)是指不能产生有活力花粉,但植株形态正常的一种母性遗传性状。它是杂种优势利用的基础,同时又是研究核质互作的理想模式系统。不结球白菜(Brassica campestris ssp.chinensis Makino)原产中国,是我国南方普遍种植的大众化的蔬菜,在蔬菜周年供应中起着举足轻重的作用。侯喜林等利用非对称细胞融合技术获得的不结球白菜胞质雄性不育系不仅克服了OguCMS不育材料低温黄化、无蜜腺的缺点,而且不育率和不育度均达到100％,结实率与保持系无显著差异,在生产上具有良好的应用前景。本研究室还利用不结球白菜与甘蓝型油菜Polima细胞质雄性不育源进行远源杂交和多代回交,成功地将不育细胞质转育到不结球白菜,获得了异质不结球白菜雄性不育材料。该不育系不育率较高,具有较好的产量、抗病性和配合力。因此对这两种不育系进行深入研究,具有重要的理论意义和实际应用价值。本研究利用cDNA-AELP技术研究不结球白菜细胞质雄性不育系及其保持系基因组的差异表达,并对得到的差异片段进行全长和表达分析,以期探讨线粒体反向调控核基因表达的信号转导途径和胞质雄性不育机理,并为指导利用CMS进行新品种选育提供理论基础。
1.通过cDNA-AFLP技术对Ogu和Pol不育系及其保持系花蕾进行基因差异表达分析,得到了27条差异表达基因,其中共有17条在不育系中差异表达,10条在保持系中差异表达,这些基因分别参与了能量代谢、信号转导、花器官发育、抗逆相关、代谢、转录等途径。我们对其中BcCAM6、BcCoi1、BcTUB3三条基因进行了实时定量PCR验证和表达量分析,结果表明BcCAM6在不育系花蕾中高表达,而BcCoi1正好相反,我们推测BcCAM6与BcCoi1基因参与了雄性不育相关的信号转导过程；而BcTUB3在雄蕊中积累,并且在不育系中下调表达,推测其在雄蕊发育过程中起到重要作用。
2.利用RACE技术成功克隆了一个在不结球白菜Ogu不育系中特异表达的ANK基因的cDNA全长序列,命名为BcANK(GenBank登录号:GU288876)。序列分析发现该基因包含ANK家族保守区域,与拟南芥锚定蛋白家族基因有95％同源性,二级结构和三级结构预测表明,该蛋白含有较多的α螺旋,介导蛋白与蛋白间的相互作用。不同组织和不同小孢子发育时期的实时定量PCR结果表明,BcANK基因在不育系的雌蕊、雄蕊和花瓣等花器官中的表达水平显著高于保持系；在小孢子发育的不同时期,该基因的表达水平在不育系中显著高于保持系,随着小孢子母细胞的发育,该基因在不育系中一直维持较高的表达量。推测不育系花蕾在败育过程中,由于线粒体功能变化而引起了一系列BcANK与的抗逆反应、细胞程序死亡和发育调控等,说明BcANK在雄性不育中起到重要的作用。
3.利用PCR技术成功克隆到一个在不结球白菜Ogu不育系中特异表达的ATPA基因DNA全长序列,命名为BcATPA。序列分析发现该基因包含F1-ATP酶α亚基保守区域,并且含有ATP结合、walker A modif和walker B modif,并含有跨膜区域。BcATPA与芸薹属中的芥菜、甘蓝型油菜和拟南芥亲缘关系最近,二级结构和三级结构预测表明,该基因与ATP结合有关。不同组织和不同小孢子发育时期的实时定量PCR结果表明,BcATPA在不育系各个器官中的表达水平比保持系高；从整个小孢子发育来看,该基因从四分体时期开始在不育系的表达量显著高于保持系,推测可能是线粒体基因Drf138和orfB共转录异常导致BcATPA异常,使线粒体发生功能的紊乱,从而影响细胞的整个代谢过程,产生雄性不育。