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为了对羊肉进行定性鉴别,本试验建立了一个多重PCR方法,可以一次性对山羊、绵羊、水貂、海狸鼠和鸭肉进行鉴别。利用线粒体基因设计五对引物,使山羊、绵羊、水貂、海狸鼠和鸭的扩增目的片段长度分别为577bp、265bp、231bp、812bp和351bp。通过特异性检测,发现各物种引物仅能扩增出相应物种,其余物种均无扩增结果;且引物和引物之间、模板和模板之间均无干扰现象。通过引物浓度优化试验,可确定各物种引物的比例为山羊:绵羊:水貂:海狸鼠:鸭=3:5:4:2:3。通过退火温度优化试验,确定了多重PCR的最佳退火温度为59℃。为了对羊肉进行定量鉴别,本试验利用荧光定量Taqman探针法PCR,在线粒体Cyt b基因上对山羊和绵羊设计特异性引物和探针,并同时在16S r RNA基因上设计内参引物和探针,对山羊和绵羊在混合肉样中的含量进行测定。本试验用DNA含量建立标准曲线,并对各物种质量与所提DNA含量的关系(D值)进行测量。通过对已知混合肉样的测量,可知山羊肉含量的平均相对误差为6.82%,绵羊肉含量的平均相对误差为8.14%。分别对多重PCR方法和荧光定量PCR方法进行灵敏性检测。试验证明,多重PCR反应的DNA模板最低检测限是0.1ng,而荧光定量PCR方法的最低检测限为0.01ng。两种方法均能用于检测经高温煮沸和高压处理的肉样。对多重PCR方法的待检肉样掺入不同比例的玉米粉,检测结果无明显影响。对含羊肉的混合肉样进行定性定量鉴定的方法步骤为:(1)提取模板DNA;(2)用多重PCR方法确定物种组成;(3)测量混合肉样组成物种的D值;(4)建立山羊或绵羊DNA标准曲线;(5)对混合肉样的DNA进行荧光定量PCR;(6)计算山羊肉或绵羊肉在混合肉样中的含量。