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白色念球菌(Candida albicans)是一种具有多种生长形态的机会性致病菌，由其所引起的念球菌病在全球范围内发病率近年来不断上升，且具有传染性和高致死率，因此对白色念球菌的研究是对念球菌病进行诊断、预防和治疗的基础，也就日益重要。白色念球菌的致病性与其在不同生长形态之间的转换能力密切相关，因此对调控白色念球菌以菌丝态生长的信号途径的研究成为研究热点。小泛素相关修饰物分子(small ubiquitin-related modifier，SUMO)通过其末端的G1y与修饰目的蛋白的Lys的ε氨基形成异构肽胺键来修饰蛋白。SUMO化修饰(Sumoylation)在信号转导、核质运输、转录调控等方面均发挥着重要的作用。SUMO化修饰是酶促可逆的，去SUMO化和SUMO前体的成熟都需要类泛素特异性蛋白酶(Ubiquitin-Like protein-specific Protease，Ulp)特异性催化。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的Ulpl(ScUlp1)切割SUMO的前体(-GGATY)而形成成熟体(．GG)，也切割SUMO的末端Gly与修饰目的蛋白的Lys的ε氨基形成异构肽的胺键，并且这种去SUMO化的功能对G2/M的细胞周期有关键性的作用。而在白色念球菌的芽颈和菌丝体形成面的蛋白被SUMO修饰，而这种修饰与白色念球菌的出芽生长和菌丝生长有密切的关系，并且在菌丝形态过程中，SUMO化修饰维持不变。但是对白色念球菌SUMO的成熟和去SUMO化所必需的特有蛋白酶还没被鉴定，因此鉴定出白色念球菌的Ulp并研究其生化特性和生理功能就具有重要的意义，有助于理解SUMO化和去SUMO化在白色念球菌在不同生长形态之间转换过程所起的调控作用。
本论文通过氨基酸同源性、保守结构分析，在白色念球菌基因组中发现有3个含有典型的Ulp结构域的基因，分别编码351、491和880个氨基酸，依据基因大小命名为CαULP1、CαULP2、CαULP3，通过对这3个基因的重组表达、纯化，首次证明了这3个基因都是白色念球菌SUMO特有蛋白酶Ulp。在寻找和鉴定白色念球菌SUMO特有蛋白酶Ulp过程中，建立一套以ScUlplc蛋白和ScSUMO-EGFP融合蛋白为参照，以CaSUMO-EGFP融合蛋白为底物，建立了白色念球菌的Ulp酶活性分析方法；并验证了在白色念球菌存在CaSUMO-EGFP的切割酶；发现了不同的物种来源细胞裂解液对CaSUMO-EGFP和ScSUMO-EGFP切割效率不同，人(Dami)、鼠(CHO)和酿酒酵母对ScSUMO-EGFP切割效率要高于对CaSU-MO-EGFP的切割效率，而酵母生长形态的白色念球菌、菌丝生长形态的白色念球菌和米曲霉的细胞裂解液则是对CaSUMO-EGFP切割效率要高于对ScSUMO-EGFP的切割效率。
通过对CαULP1、2、3基因在原核与毕赤酵母的重组表达发现，在原核(E．coli)中虽然表达出可溶性蛋白，但没有检测到SuMO切割活性，而在毕赤酵母表达出的蛋白才具有SUMO切割活性，随后通过Western blot分析和亲和层析纯化重组蛋白的SDS-PAGE显示毕赤酵母表达的CaULP1、2、3蛋白其分子量都要大于理论值，显示CaUlP1、2、3蛋白可能被修饰。这显示白色念球菌的Ulp与酿酒酵母的Ulp不一样的，白色念球菌的Ulp需经蛋白翻译后的修饰才能有活性。
为了提高CαULP基因在毕赤酵母的表达量，采用了体外构建CαULP1表达框架的多拷贝质粒。在这过程中，我们建立一种新型的体外体外构建含有多拷贝表达框架的质粒方法，与原有的方法相比具有操作简便、多拷贝定向串联效果好、可控制拷贝数以及转化效率高等优点。利用这种方法，构建和筛选到了含4个拷贝的表达框架，与单拷贝表达框架相比，CαULP1在毕赤酵母表达活性提高了40％，随后通过Ni-NTA亲和层析纯化了重组活性CaUlP1蛋白。酶活测定表明，纯化蛋白活性浓度为300 U/μl。
通过基因敲除试验发现CαULP1和CαULP3对白色念球菌生长是必须的，而CαULP2并不是白色念球菌生长所必须的。随后的RT-PCR和定量PCR结果显示，在酵母形态和菌丝形态生长的细胞中，CαULP2是检测不到有表达，CαULP1在这2种生长形态其表达量几乎没有变化，而CαULP3从酵母生长形态到菌丝生长形态，表达量下降60％。而根据氨基酸序列分析，CαULP1含有典型的核定位信号(nuclear localization signal，NLS)定位在核孔中；而CaUlP3则没有明显的定位信息，很可能是定位在细胞质中，而根据目前的研究报道，白色念球菌中SUMO修饰是发现在细胞质中的。因此根据上述结果，我们推测CaUlp3很可能参与了白色念球菌从酵母生长形态和菌丝生长形态转化的调控。我们构建了HisCaSUMO-的融合表达载体，并挑选4个在其它融合表达系统中难以表达人类基因，构建His-CaSUMO-ORF的原核表达载体。随后在Ecoli中重组表达，然后纯化获得的蛋白与CaUlp1/His蛋白于16℃分别反应0min，30min，60min，120min和过夜，结果显示反应30min就能切割完全，另外延长反应时间到过夜(16 h)，其蛋白带型也不会发生变化，说明了CaUlp1/His蛋白对HisCaSUMO融合蛋白的切割高特异性和高效率，具有组成一套完整的融合蛋白表达纯化体系的潜在应用价值。