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猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪轮状病毒(PoRV)是引发猪病毒性腹泻的主要病原,且三种病原常常混合感染,建立同时检测三种病原的特异性检测方法,在临床诊断上具有重要意义。本研究根据GenBank登录的PEDV S基因、TGEV S基因和PoRV VP6基因序列保守区设计合成引物,建立了RT-PCR多重快速检测方法。利用这3对引物对同一样品中的PEDV、TGEV、PoRV核酸模板析进行多重RT-PCR扩增,结果显示：该方法可以同时扩增PEDV S基因(682bp), TGEV S基因(480bp)和PoRV VP6基因(297bp)的特异性DNA片段,其三对扩增引物对除白身病毒以外的其他两种腹泻病毒及猪瘟病毒和猪伪狂犬病毒的PCR扩增结果均为阴性：敏感性测定结果表明,该多重RT-PCR方法检测灵敏性分别达到PEDV模板3.3×103copies/μL、TGEV模板3.2×103copies/μL和PoRV模板2.8×103copies/μL。用20份临床病料对本研究建立的多重RT-PCR和单-RT-PCR方法进行对比验证,结果显示：两者的总符合率为100%。该PCR反应体系为总体积25μL,Taq酶(5U/μL)0.5μL,引物量(PEDV0.8pmol/μL、TGEV1.0pmol/μL、PoRV1.0pmol//uL)0.5,uL,35个循环,总反应时间94min,结果表明,建立的多重RT-PCR检测方法,具有特异、快速、准确的特点,可用于对这3种病毒的同时检测和鉴别诊断。根据PEDV、TGEV及PoRV的ORF3基因和S基因以及VP7基因,设计的三对特异性引物进行的PCR反应,扩增出的目的片段分别为103bp、115bp和153bp,目的基因和载体pMD18-T连接产物转化到感受态细胞JM-109,提取重组质粒,进行PCR鉴定并测序。重组质粒测OD-,60并计算其浓度,根据公式进行拷贝数计算。梯度稀释重组质粒制备标准品,分别建立了检测3种病毒的SYBR green I实时荧光定量PCR方法。建立的PEDV、TGEV及PoRV标准曲线且线性关系良好,相关系数分别为0.992902、0.987219和0.999045,扩增效率分别为0.93、0.99、1.15。特异性试验结果表明,PEDV特异性试验中TGEV、PoRV、 PRV、HCV均为阴性；TGEV特异性试验中PRV、PoRV、PEDV、HCV均为阴性；PoRV特异性试验中PRV、PEDV、TGEV、HCV均为阴性;敏感性试验表明,3种病毒SYBR Green I荧光定量PCR方法的最低检测下限分别为33copies/μL、32copies/μL、28copies/μL;重复性试验结果显示三种检测方法的批内变异系数和批间变异系数均小于5%。说明本实验建立的3种病毒的SYBR Green I荧光定量PCR方法的特异性、敏感性和重复性良好。应用建立的检测方法分别对黑龙江、内蒙等地的20份临床粪便样品进行检测,结果可见PEDV、TGEV及PoRV荧光定量PCR方法检测阳性率分别为70%、50%、35%,单一RT-PCR方法检测阳性率分别为60%、45%、20%。本研究建立的猪腹泻病毒多重和SYBR Green I荧光定量PCR检测方法为猪病毒性腹泻的流行病学调查及诊断与防制提供了基础。