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宫颈癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一，在世界范围内发病率居第二位，仅次于乳腺癌，每年约有超过50万新发病例。2007年有25万人因此丧生，其中80％的病例发生在发展中国家。中国每年约有新发病例13.15万，占世界新发病例的30％。近年来，宫颈癌的发病年龄趋向年轻化，成为严重威胁中青年妇女健康的重大妇科肿瘤之一。
通过大量的临床、分子生物学及流行病学研究，人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus，HPV)已被证实是引起宫颈癌及宫颈上皮内瘤变(CIN)的主要病因。女性中HPV感染非常普遍，多数可自然清除，仅少数持续性感染，并可发展为CIN，最终进展为浸润性宫颈癌。宫颈癌主要的病理类型有宫颈鳞癌和腺癌，HPV16与宫颈鳞癌有关，HPV18与宫颈腺癌有关，但宫颈癌发生的具体分子机制尚不明确。
微小RNA(microRNA，miRNA)是一类长约22个核苷酸的单链非编码RNA，通过与靶mRNA完全或不完全互补配对，导致靶基因降解或抑制其翻译，从而在基因的表达调控中发挥着重要作用。miRNA参与了动植物许多复杂的生命过程，包括发育、器官形成、凋亡和细胞增殖等。研究表明，miRNAs表达异常与恶性肿瘤发生关系密切，miRNAs很可能是一类潜在的癌基因或抑癌基因。最近有研究(1)发现HPV16阳性的细胞系、宫颈损伤和宫颈癌组织与正常宫颈组织、HPV阴性的宫颈癌细胞系相比，miR-218的表达存在差异，提示miR-218的表达失衡可能参与了宫颈癌的发病过程。目前国内外尚无miR-218与宫颈癌恶性程度相关性的报道，而且文献报道的miR-218在宫颈癌中的表达只检测了HPV16阳性细胞株和少数几例宫颈癌标本，并且这种检测只是局限于组织中。而血清作为生物检测样本，具有取材方便，无创伤性，可连续体外检测的优点，且血清miRNA的高度稳定性也使得病人的实际值与实验的测试值相当吻合。因此有必要深入开展miR-218在宫颈癌中的表达和功能研究，以及对血清中的表达进行检测，为深入研究宫颈癌的发病机理、早期诊断和治疗提供一种新的理论与实验基础。
基于此，本课题的研究内容包括以下两部分：
第一部分:miR-218的表达水平与宫颈癌恶性程度的相关性
背景和目的：宫颈癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一。在15种致癌性HPV病毒中，HPV16最为常见，HPV16阳性宫颈癌在所有宫颈癌中所占比例超过了50％。与正常宫颈组织、HPV阴性的宫颈癌细胞系相比，HPV16阳性的宫颈癌细胞系、宫颈损伤和宫颈癌组织中miR-218特异性低表达。在本研究中，我们检测了正常宫颈组织、宫颈癌细胞系、癌前病变和宫颈癌中miR-218的表达状况，检测了宫颈癌患者血清中miR-218的表达水平，旨在探讨miR-218的降低程度与感染的HPV型别、宫颈癌恶性程度的关系，探讨宫颈癌组织和血清中miR-218表达水平的相关性，以及探讨血清中miR-218的表达水平能否反映宫颈癌的恶性程度，为以后的早期诊断提供一种实验基础。
材料和方法：本研究收集了22例子宫肌瘤患者的正常宫颈组织作为对照组，收集了78例宫颈癌患者手术标本、22例石蜡包埋标本和18例宫颈癌患者的血清标本作为实验组，检测了miR-218在正常宫颈组织、宫颈癌细胞系、癌前病变和宫颈癌中的表达，采用导流杂交法检测了感染的HPV的型别，探讨了miR-218的表达水平与HPV型别、宫颈癌恶性程度的相关性。对于收集到的部分宫颈癌患者的血清标本，我们分离得到了小分子RNA，检测了miR-218的表达，使用Pearson's相关系数描述了组织和血清中miR-218表达水平的相关性。
结果：
1.我们成功建立了检测miR-218表达的实时定量RT-PCR方法(UPL法)，确定了其检测的线性范围。
2.验证了HPV16阳性细胞系SiHa中miR-218的低表达。检测到在HPV18阳性的细胞系HeLa中，miR-218也呈低水平表达。
3.高危型HPV感染的组织标本中miR-218表达低于低危型组织标本和对照组标本，低危型感染组与对照组中miR-218表达水平的差异无统计学意义。
4.在正常组织、CIN和宫颈癌中，miR-218由高到低依次是：正常组织>CINI>CINⅡ～Ⅲ>宫颈癌；而且，miR-218在宫颈癌患者血清中也呈低水平表达，与组织中的低表达存在相关性。
结论：
1.HPV18(+)的宫颈癌细胞系HeLa中miR-218呈低水平表达。
2.宫颈癌和癌前病变中，高危型HPV感染组织中miR-218呈低水平表达。
3.随着宫颈癌恶性程度的升高，miR-218的表达水平呈进行性降低，这种降低可以反映在血清中。
第二部分:miR-218在宫颈癌发病机制中作用的初步探讨
背景和目的：miR-218与宫颈癌的恶性程度密切相关，但在宫颈癌发病机制中所起的作用尚不清楚。本研究在体外人为改变宫颈癌细胞株中miR-218的表达，检测其对细胞生物学活性的影响，并初步探讨其影响机制。
材料和方法：在脂质体siPORT NeoFX的介导下，将Pre-miR miRNA Precursor、Anti-miR miRNA Inhibitors以及对应的阴性对照分别转染入C-33a、SiHa和HeLa细胞株中，检测不同时间点miR-218表达水平的改变，用MTT、流式细胞术检测其对各组细胞的增殖、凋亡、细胞周期的影响，用RT-PCR方法检测了PI3K调节亚单位p85 mRNA的表达，并用Western blotting检测了转染前后p85，Akt及p-Akt的表达。
结果：
1.我们成功地将miR-218转染入SiHa细胞，转染后24小时，miR-218水平改变最为显著，随时间的延长，逐渐趋向正常水平。
2.在转染后的24小时，miR-218水平升高可促进SiHa、HeLa细胞增殖，抑制细胞凋亡；miR-218水平降低可抑制SiHa、HeLa的增殖，对细胞凋亡有促进倾向，但无统计学意义。在转染后的48，72小时，这种促进或抑制作用消失。miR-218表达水平的改变对SiHa、HeLa细胞的细胞周期均无影响。对于C-33a，miR-218的表达水平改变对其增殖、凋亡和细胞周期均无影响。
3.miR-218水平升高可促进PI3K调节亚单位p85a蛋白的表达和下游效应蛋白Akt的磷酸化，反之抑制p85蛋白的表达和Akt的磷酸化，对p85αmRNA的表达无影响。
结论：虽然miR-218随着宫颈癌恶性程度的升高而表达降低，但是体外实验表明升高miR-218的表达水平对肿瘤细胞系SiHa、HeLa的生长表现出促进作用，降低miR-218的表达对SiHa、HeLa的生长表现出抑制作用，而且只有当miR-218处于高浓度时才表现出这些作用，这说明miR-218对肿瘤细胞作用的复杂性，需要进一步进行体内实验才能充分体现出它的作用。
本研究的创新点:
1.本研究证实了miR-218的表达水平与感染的HPV型别、宫颈癌恶性程度密切相关，而且这种相关性可以反映在血清中。
2.本研究首次检测了miR-218在体外对宫颈癌细胞系生物学活性的影响，并初步研究了其影响的信号通路。