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斜纹夜蛾属于鳞翅目夜蛾科,是世界性重要的农业害虫。该虫具有分布广、爆发快、繁殖能力强和杂食性等特点,在世界范围内对经济作物造成严重的损失。随着农业害虫治理过程中该害虫对化学杀虫剂抗性问题的不断出现,寻找开发延迟抗性发展的新型微生物农药成为了亟待解决的问题。营养期杀虫蛋白是在苏云金芽胞杆菌生长到对数中期至稳定期期间产生并分泌到胞外的一类蛋白,由于该类毒素与Cry毒素不具有序列同源性,使其对某些Cry毒素不敏感害虫具有较高的毒性作用,对于扩大杀虫谱、延缓抗性的产生具有重要意义。本研究从本实验室保存的苏云金芽胞杆菌WB5菌株克隆、表达和纯化获得Vip3Aa毒素蛋白,测定了其对棉铃虫、甜菜夜蛾和斜纹夜蛾的毒性;以斜纹夜蛾为靶标对象,分析了其在Vip3Aa毒素蛋白胁迫下的转录应答反应;在转录组数据分析的基础上,对涉及Vip3Aa毒素蛋白杀虫机理的两个环节--酶解活化及其在斜纹夜蛾中肠潜在的作用受体进行了分析。以苏云金芽胞杆菌WB5菌株的总DNA为模板,利用设计的引物Vip3A-F/Vip3A-R扩增出全长的vip3Aa基因。采用克隆载体pMD18-T直接从PCR产物中克隆到完整的vip3Aa基因,序列测定结果表明:该基因(GenBank登录号为AAM22456)编码框长2370 bp,编码含有789个氨基酸残基的蛋白质,推算其相对分子质量为88 kDa。氨基酸序列同源性分析结果表明其编码的蛋白质与NCBI上已报道的同类蛋白的同源性达99%以上。将克隆的vip3Aa基因连接到表达载体pCzn1,构建了重组表达质粒pCzn1-vip3Aa,将其转化大肠杆菌BL21,筛选出的转化子用0.2 mmol/L IPTG进行诱导表达,SDS-PAGE结果表明:在沉淀和上清中均有约88 kDa的融合蛋白表达产物。利用Ni-IDA-Sepharose CL-6B亲和层析柱对融合表达的蛋白产物进行纯化,获得纯的Vip3Aa蛋白。采用人工饲料饲喂法对获得的纯Vip3Aa蛋白的杀虫谱进行了初步测定,结果表明:在供试的3种鳞翅目昆虫中,斜纹夜蛾对其最敏感,其次是甜菜夜蛾,但棉铃虫对其不敏感。Vip3Aa蛋白对斜纹夜蛾初龄幼虫、一龄幼虫、二龄幼虫和三龄幼虫的LC50分别为 2.609 ng/cm2、28.778 ng/cm2、70.460 ng/cm2 和 200.627 ng/cm2。对斜纹夜蛾三龄幼虫取食Vip3Aa蛋白24 h后的中肠组织病理学观察显示其中肠肠上皮肿胀,细胞质基质空化,微绒毛短小、变形、脱落,细胞核变形、染色质呈块状聚集,线粒体变形。以斜纹夜蛾为靶标对象,构建了其完整的转录组数据库,共得到50.09 Gb Clean Data,经组装后共得到56,498条Unigene,其N50为1,853 bp、平均长度为827.6 bp。其中,共有 21,701 条 Unigene 通过 Nr、SwissProt、Pfam、KOG、KEGG、GO、COG数据库获得了注释。经Nr数据库比对,斜纹夜蛾的物种分布比较接近于家蚕和大红斑蝶;通过GO数据库将Unigene主要分为细胞组分、分子功能和生物学过程三大类,对基因产物所处的细胞环境,以及可能行使的分子功能和参与的生物学过程进行了描述;通过KEGG数据库对Unigene可能参与的通路进行了注释。同时,从全虫与中肠的转录表达差异对斜纹夜蛾在Vip3Aa毒素蛋白胁迫下的应答反应进行了研究,结果表明Vip3Aa毒素处理引起了斜纹夜蛾幼虫广泛的应答反应。经Vip3Aa毒素处理后,斜纹夜蛾全虫组发现37个免疫相关基因(包括12个信号识别相关基因,8个黑化作用相关基因,7个信号传导相关基因,7个效应因子相关基因以及3个其他免疫基因)发生了差异表达,且大部分基因出现上调的状态,表明斜纹夜蛾幼虫能够启动免疫反应;发现127个明显差异表达的代谢相关基因,所参与的基本代谢体系为氨基酸代谢、辅酶因子与维生素代谢、脂代谢、外源物质降解与代谢以及碳水化合物代谢,同时发现36个可能与解毒代谢相关的DEG(主要是谷胱甘肽转移酶基因和细胞色素P450基因),其中大部分表现为上调状态,说明斜纹夜蛾幼虫能够启动解毒代谢途径。斜纹夜蛾中肠组经Vip3Aa毒素处理后,中肠内47个丝氨酸蛋白酶类基因发生差表达,主要注释为胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶及丝氨酸蛋白酶;也发现4种常见Bt毒素受体蛋白基因发生差异表达,包括4个碱式磷酸酶基因、4个G蛋白受体基因、2个钙黏蛋白基因和1个氨肽酶N基因。通过斜纹夜蛾中肠对照与全虫对照中丝氨酸类蛋白酶基因表达的比对分析,发现这些基因在斜纹夜蛾中肠内大量表达,结合Vip3Aa毒素蛋白胁迫下斜纹夜蛾中肠组这类基因的差异表达情况,推测这些蛋白酶很可能参与了 Vip3Aa毒素蛋白的溶解过程。由于丝氨酸蛋白酶的复杂性,选取胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶对Vip3Aa毒素蛋白进行体外酶解活化验证。以干酪素为通用底物的酶谱分析证实了斜纹夜蛾幼虫中肠酶液中含有胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶;利用斜纹夜蛾中肠酶液、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的体外酶解分析结果表明它们均能酶解Vip3Aa毒素蛋白;对斜纹夜蛾初龄幼虫的生测结果显示,经胰蛋白酶与胰凝乳蛋白酶体外酶解后的Vip3Aa毒素蛋白具有较高毒性,半致死浓度LC50分别为77.052 ng/cm2和118.26 ng/cm2,且两种酶酶解后Vip3Aa毒素蛋白能够对斜纹夜蛾幼虫中肠组织造成破坏。这些结果证明了胰蛋白酶与胰凝乳蛋白酶参与了 Vip3Aa原毒素蛋白在斜纹夜蛾肠道的酶解活化过程。利用生物素化Vip3Aa活性片段的Pull-down结果表明,活化后的Vip3Aa蛋白能够与斜纹夜蛾中肠BBMV上的潜在受体结合,SDS-PAGE电泳显示在约62 kDa、55 kDa、43 kDa、30 kDa的位置均能检测到条带;以Vip3Aa兔源抗血清为一抗,通过Western blot确定了 Vip3Aa毒素蛋白的核心活性片段大小约为62 kDa;以生物素化Vip3Aa活性片段为一抗、带荧光标记的亲和素为二抗,通过Ligand Blot显示在约129 kDa、87 kDa、52 kDa、47 kDa的位置可检测到Vip3Aa毒素潜在受体的荧光条带;通过Shotgun质谱分析及Uniprot数据库、斜纹夜蛾转录组数据库对Pull-down得到的蛋白质进行了鉴定,在Uniprot蛋白质数据库共比对到11条蛋白序列,在本研究获得的斜纹夜蛾转录组数据库共比对到168条匹配序列,结合Vip3Aa毒素处理后产生的Bt毒素受体蛋白基因差异表达分析,推测 APN(c18942;c18980;c18685;c5990)序列,G protein(c19499)和ABCC2(C19529)有可能是本研究中Vip3Aa毒素蛋白的潜在受体。