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目的评价转人乳铁蛋白基因水稻(genetically modified rice with human lactoferrin gene, hLF)的营养成分、铁的生物利用率及对大鼠缺铁性贫血的改善作用；观察重组人乳铁蛋白的(recombinant human lactoferrin gene, rhLF)致敏性和毒性,以评价从转hLF水稻提取纯化后的人乳铁蛋白的食用安全性；观察rhLF在体外的抑菌效果和在小鼠体内抑制沙门氏菌感染的效果,以评价rhLF的特殊功效；评价转GmDREB1/TaDREB4基因抗旱小麦的营养学价值。材料与方法1转人乳铁蛋白基因水稻的营养成分和特殊功效评价1.1营养成分分析和乳铁蛋白的检测采用国标方法测定转hLF水稻和亲本对照水稻的蛋白质、碳水化合物、脂肪、纤维素、维生素、矿物质和抗营养因子等成分；采用ELISA定量检测转基因水稻中乳铁蛋白的含量。1.2铁的生物利用率研究采用体外消化/Caco-2细胞模型测定转hLF水稻和对照亲本水稻中铁的吸收率。1.3改善大鼠缺铁性贫血的研究选取刚断乳雌性Wistar大鼠,体重45-55g。适应喂养7d后喂饲低铁饲料4周,造成缺铁性贫血模型。将达到贫血状况的大鼠按血红蛋白和体重随机分成8组,分别是硫酸亚铁组、AIN组、对照大米高剂量、对照大米中剂量、hLF高剂量、hLF中剂量、牛乳铁蛋白组和贫铁对照组,各组分别喂饲相应组别的饲料。每周记录1次体重,2次进食量。实验初期、实验中期和实验结束时各检测血常规1次。2重组人乳铁蛋白的提取纯化、食用安全和特殊功效评价2.1转基因水稻中提取纯化rhLF及鉴定采用饱和硫酸铵盐沉淀、弱阳离子交换层析、分子筛层析等方法提取和纯化rhLF;采用Westernblot鉴定纯化后的rhLF;采用凝胶图像分析软件分析rhLF的纯度；采用质谱法测定纯化后蛋白的分子质量、蛋白质质量和C端氨基酸序列,采用等电聚焦电泳法测定等电点。2.2生物信息学分析和血清致敏性研究将从转基因水稻中提取纯化后的rhLF与allergenonline、SDAP、Blast和Sortaller等常用致敏性分析数据库中的致敏蛋白进行同源性比对,包括全序列比对、连续80个氨基酸序列同源性比较和8个连续相同的氨基酸序列匹配；采用26例过敏患者血清,包括12例螨过敏血清、4例大豆过敏血清、6例花生过敏血清、4例猫过敏血清开展Westernblotting试验以进行过敏筛选。2.3消化稳定性和热稳定性研究配制模拟胃液/肠液消化液,建立体外模拟胃肠体系,以及模拟热处理加工环境,观察从转基因水稻中提取纯化后的rhLF在模拟胃液/肠液的Os,15s,30s,60s,2m,4m,8m,15m,30m和60min内的降解情况,以及在加热后5m,10m,15m,20m,30m,45m,60m,90m和120m的降解情况,各时间点样品中的蛋白通过SDS-AGE电泳检测分析。2.4急性毒性研究根据国标15193.3-2003的标准方法进行。选择昆明小鼠60只,雌雄各半,6周龄,体重17-22g。适应喂养7d后按体重按性别和体重分别随机分成3组：大米来源的rhLF组,去离子水对照组,BSA对照组,每组20只,雌雄各半。采用最大耐受量法一次性经口灌胃小鼠。每组每只灌胃平均容量为20ml/kg·BW,即0.4ml/20g。灌胃完毕,观察并记录实验动物的中毒表现和死亡情况。每周记录两次摄食量,记录小鼠0(灌胃当天),3,7和14天体重。实验结束后处死所有小鼠并进行解剖,称量脑、心脏、肺等脏器重量,计算脏体比。2.5体外抗菌活性研究采用微量肉汤稀释法将转基因大米来源的rhLF和转基因牛乳来源的rhLF终浓度分别调节至0.25,0.5,1.0,2.0,4.0和5.0mg/ml。观察rhLF对5种革兰氏阴性菌,包括菌铜绿假单胞菌ATCC27853、阪崎氏肠杆菌ATCC51329、鼠伤寒沙门氏菌ATCC50333、大肠杆菌ATCC25922和宋氏志贺菌CMCC51592;3种革兰氏阳性菌包括金黄色葡萄球菌ATCC29213、单增李斯特菌CMCC54004和蜡样芽孢杆菌ATCC11778的抑制情况。分别在培养后0h,2h,4h,6h,9h,18h和24h的测定菌液的OD620。将没有添加rhLF的菌液设为阳性对照,没有接种菌的BHI肉汤设为阴性对照。2.6小鼠体内沙门氏菌感染的抑制效果研究LDso的确定选择6-8w雌性Balb/c小鼠,体重17-20g。适应性喂养5天后,将Balb/c小鼠按体重随机分为4组,每组10只,经口灌胃鼠伤寒沙门氏菌ATCC50333,进行毒力鉴定,确定沙门氏菌的LD50。选择LDso的1/5和1/10作为染菌量。rhLF抑制小鼠沙门氏菌(Salmonella typhimurium ATCC50333, ST)感染的效果选取与上述实验条件相同的Balb/c小鼠,并按体重将其随机分为5组,每组12只,分别是：L ST(沙门氏菌低浓度)；L ST+牛rhLF组；H ST(沙门氏菌高浓度)；H ST+牛rhLF组；H ST+米rhLF组。染菌前2小时rhLF蛋白组经口一次性灌胃rhLF20mg/ml,经口灌胃染菌后,每天灌胃rhLF,连续7天。对照组给予同样体积的PBS。期间每天称量小鼠体重,观察小鼠的一般行为表现和发病情况。7天后,行心脏穿刺取小鼠血检测菌血症,取肝脏和脾脏组织研磨后进行细菌计数分析,取肝脏、脾脏、肾脏和小肠进行病理观察。3转GmDREB1/TaDREB4基因抗旱小麦营养学评价3.1营养成分分析采用国标方法测定转GmDREB1/TaDREB4基因抗旱小麦和亲本对照小麦的蛋白质、碳水化合物、脂肪、纤维素、维生素、矿物质等常规营养成分,以及18种氨基酸含量。3.2蛋白质功效比(Protein Efficiency Ratio, PER)评价按照农业部行标(2012年立项标准),采用大鼠28天喂养试验评价转GmDREB1/TaDREB4基因两种抗旱小麦的蛋白质功效比。选取初断乳Wistar大鼠80只,雌雄各半,体重55-65g。根据PER评价要求,以小麦中蛋白质最大掺入为原则,使各组饲料的蛋白质含量达到10%配制饲料。大鼠适应喂养7d后按体重随机分为4组,分别饲喂转GmDREB1基因抗旱小麦饲料、转TaDREB4基因抗旱小麦饲料、非转基因对照亲本小麦饲料和酪蛋白对照饲料(酪蛋白对照组),每周记录体重1次,进食量2次。实验结束时检测血常规、血生化,并处死大鼠进行解剖,称量脑、心脏、肝脏、肾脏、脾脏、睾丸和附睾/卵巢的绝对重量并计算脏体比,计算各组PER和校正PER。结果1转人乳铁蛋白基因水稻的营养成分和特殊功效评价营养成分分析和乳铁蛋白的检测结果表明,转hLF水稻与亲本对照水稻在主要营养成分上含量相似,变化程度不明显。在矿物质和维生素上,除个别元素如铜和磷(P<0.05),大部分元素含量没有显著性差异(P>0.05)；在hLF大米中检测到hLF的表达,其含量约为种子干重的0.5%。体外消化/Caco-2细胞模型评价铁的生物利用率研究结果表明,转hLF水稻与亲本对照水稻中铁的生物利用率没有显著差异(P>0.05)。改善大鼠缺铁性贫血效果评价的研究结果表明,在试验恢复中后期,除贫铁组外,其余组体重和进食量明显增加,组间没有显著差异(P>0.05)。血常规检测中,与贫铁组比较,硫酸亚铁组、AIN组、hLF高剂量、hLF中剂量和牛乳铁蛋白组Hb, RBC和其余各项血液指标均显著提高(P<0.05),对照大米高中剂量组Hb也有明显增加(P<0.05)。与对照大米高中剂量组比较,hLF高剂量、hLF中剂量和牛乳铁蛋白组Hb较低且差异有统计学意义(P<0.05),除牛乳铁蛋白组RBC较低外(P<0.05),其余组RBC与对照大米高中剂量组相比,没有显著性差异(P>0.05)。2重组人乳铁蛋白的提取纯化、食用安全和特殊功效评价转基因水稻中rhLF的提取纯化及鉴定结果表明,通过饱和硫酸铵分级沉淀从转基因水稻中分离到重组人乳铁蛋白,经阳离子交换层析、分子筛层析纯化及超滤浓缩后,成功获得纯度较高的人乳铁蛋白,纯度约为90%。rhLF分子量约为79K Da,经Westernblot检定确定为rhLF,等电点为8.02,蛋白质C端15个氨基酸序列与天然人乳铁蛋白C端序列一致,蛋白质肽指纹图谱结果显示,与天然人乳铁蛋白可匹配。生物信息学分析结果表明,rhLF与己知致敏原牛乳铁蛋白、鸡卵转铁蛋白存在很高的序列相似性。血清致敏性研究中,Westernblotting试验结果表明,大部分过敏血清与rhLF没有交叉反应,有2例螨虫过敏血清对rhLF呈现阳性反应。两部分结果提示rhLF可能存在引起过敏反应的风险。消化稳定性和热稳定性研究结果表明,rhLF在模拟胃液中30s内可完全降解,表明该蛋白在模拟胃液中极易消化,不具稳定性；在模拟肠液中仍有明显条带,表明该蛋白在模拟肠液中稳定,不易消化。热加工稳定的结果显示rhLF蛋白15m后可完全降解,表明该蛋白对热不稳定。急性毒性研究结果表明,雌雄小鼠都没有出现明显的不良反应甚至死亡等异常表现,小鼠体重、进食量、各脏器的脏体比与对照组之间也无明显差异。rhLF的LD50≥6.68g/kg。体外抗菌活性研究结果表明,与阳性对照组比较,水稻及牛乳两种来源的rhLF对8种菌株均有不同程度的抑制效果(P<0.05)。在5种革兰氏阳性菌中,两种来源的rhLF对铜绿假单胞菌、阪崎细菌、鼠伤寒沙门氏菌抑制程度相当,效果明显且持续时间长；对大肠杆菌和宋氏志贺菌的抑制效果稍弱,只在较高浓度表现出抑制作用。在3种革兰氏阴性菌中,两种来源的rhLF对金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢菌的抑制程度相当,效果明显；牛乳来源的rhLF对单增李斯特菌的抑制效果强于大米来源的rhLF。小鼠体内沙门氏菌感染的抑制效果研究结果表明,染菌后,给予rhLF的小鼠精神状况优于对照组。各组小鼠体重7天内的变化没有明显的差异(P>0.05)；死亡数目在组间没有明显的差异(P>0.05)；与L ST细菌对照组比较,L ST+牛rhLF组小鼠的脾脏湿重和脾体比值显著降低(P<0.05),脾脏染菌的小鼠数目明显减少(P<0.05),肝脏和脾脏的含菌量也明显减少(P<0.05)。在高浓度染菌组中,与H ST细菌对照组比较,H ST+牛rhLF组和H ST+米rhLF组2组小鼠血液、肝脏和脾脏的染菌量均有所降低,但组间差异没有统计学意义(P>0.05)。3转GmDREB1/TaDREB4基因抗旱小麦营养学评价营养成分分析结果显示,与亲本对照小麦比较,除个别元素如脂肪和色氨酸外,两种转基因抗旱小麦在主要营养成分、矿物质和维生素等常规成分中均没有显著性差别(P>0.05),17种氨基酸含量在组间也没有显著性差异(P>0.05)。蛋白质功效比PER评价结果显示,各组动物一般状况良好,行为正常。与亲本对照小麦比较,两种转基因抗旱小麦组大鼠四周的体重增长和进食量没有显著性差异(P>0.05)；血常规、血生化和脏体比的个别指标上具有显著性差异(P<0.05),但这些差异尚在正常参考值范围内；两种转基因抗旱小麦与亲本对照小麦比较,PER没有显著性差异(P>0.05),表明转基因组的蛋白质功效比等同于亲本对照组；两种转基因抗旱小麦PER均比酪蛋白对照组低(P<0.05),表明转基因小麦的蛋白质功效比劣于酪蛋白。经校正,转GmDREB1基因抗旱小麦、转TaDREB4基因抗旱小麦和亲本对照小麦PER值依次为0.76、0.75和0.67。结论1转人乳铁蛋白基因水稻的营养成分和特殊功效评价转人乳铁蛋白基因水稻乳铁蛋白含量达到0.5%,与国外相关研究报道的含量一致。与亲本对照水稻相比,未见转人乳铁蛋白基因水稻在铁的生物利用率和大鼠缺铁性贫血的改善作用中有明显效果。2重组人乳铁蛋白的提取纯化、食用安全和特殊功效评价从转人乳铁蛋白基因水稻中可以成功的提取和纯化rhLF,纯化后的人乳铁蛋白与天然人乳铁蛋白的性质基本相似。生物信息学分析和血清致敏性研究结果提示rhLF可能存在引起过敏反应的凤险。大米来源的rhLF在胃液中不具稳定性,在肠液中不易消化,对热加工不具稳定性。急性毒性研究结果提示,rhLF是实际无毒的蛋白质。体外抗菌活性研究结果提示大米和牛乳来源的rhLF对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有抑制效果,都具有广谱的抗菌活性。小鼠体内沙门氏菌感染的抑制效果研究结果提示rhLF可以降低沙门氏菌感染小鼠体内的细菌含量,rhLF能预防和减轻由细菌引起的炎症反应。3转GmDREB1/TaDREB4基因抗旱小麦营养学评价转GmDREB1/TaDREB4两种转基因抗旱小麦的营养成分和蛋白质功效比与亲本对照组没有差异。