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丝状真菌米曲霉在食品酿造行业已有上千年的应用历史并且符合食品安全标准(GRAS)。同时由于米曲霉具有强大的蛋白分泌能力与真核生物的蛋白修饰功能,使它成为一种常用的产酶宿主。 α-淀粉酶,也称α-1,4-葡萄糖苷水解酶,是一种内切淀粉酶,能将淀粉分子从内部断裂成寡糖。来源于细菌的高温淀粉酶和真菌的中温淀粉酶在各个行业,如造纸、纺织、医药、洗涤、与食品加工行业等都有重要应用。而低温淀粉酶尚处于研究中。 本课题以野生型米曲霉RIB40作为出发菌株,通过同源重组的方法敲除pyrG基因,又利用pyrG基因作为筛选标记敲除基因ligD并进行pyrG基因的标记回收,从而得到ligD缺失的尿嘧啶营养缺陷型菌株△pyrG△ligD作为后续实验的表达宿主。 以pBlueScript SKII(+)为骨架,构建了米曲霉表达载体pSKNHG。该表达载体中依次插入了米曲霉的amyB启动子、终止子、信号肽、及His-Tag标签,最后嵌入回补基因pyrG。 本课题通过NCBI数据库挖掘,提取RNA并反转录克隆获得了来源于南极菌Geomyces pannorum R2-1的α-淀粉酶。该淀粉酶序列有1482bp,由492个氨基酸构成。将此淀粉酶命名为AmyA1。该蛋白酶与同样来源于G.Pannorum的α-淀粉酶(Genbank Accession No.AHN65136.1)同源度最高,仅为66％;与其他来源的淀粉酶同源度较低,与来源于Lipomyces kononenkoae的α-淀粉酶(Genbank Accession No.AAO12212.1),同源度为54％;;与来源于Aspergillus kawachii IFO4308的α-淀粉酶(Genbank Accession No.XP_007584707.1)则只有44％的同源度。 将淀粉酶AmyA1的cDNA插入pSKNHG中构建重组表达质粒,随后将其在米曲霉中异源表达。重组的α-淀粉酶经过超滤与亲和纯化之后进行淀粉酶酶学性质研究。SDS电泳显示该酶分子量大小约为52kDa。该酶的比活为12.8×103U/ml。以可溶性淀粉为底物,该酶的动力学参数Km与Vmax分别为25.1mg/ml与0.824mg/(ml·min)。此外测得AmyA1的最适温度与最适pH分别为50℃与5.0。Ca2+和Mg2+对其酶活力有促进作用,而Ni2+、表面活性剂(Teween-20、Teween-80和TritonⅩ-100)和甲醇则会明显抑制酶活;底物特异性分析表明该酶除了对普鲁兰催化活力较低之外,其他直链和支链淀粉均能被降解;通过液相色谱分析测定其水解可溶性淀粉的产物,结果显示反应48h后降解液中主要为葡糖糖、麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖与麦芽五糖,总降解率达到86.4％。 使用纳米Fe3O4对重组淀粉酶进行固定化。结果显示固定化酶的比活力损失很少。 此外,固定化酶相较于游离酶最适温度从50℃变为60℃,最适pH从5.0变为6.0。在重复实用性实验中,固定化酶在应用6个循环后仍能保留60％以上的酶活力。