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β-葡萄糖苷酶是纤维素水解的关键酶之一,但是目前纤维素酶生产菌株所产β-葡萄糖苷酶普遍含量少、活性低,严重制约纤维素酶解技术的发展。本研究以绿色木霉GIM3.139为试验对象,首先优化其发酵条件,在最佳发酵条件下,分离纯化得到电泳纯的β-葡萄糖苷酶,进行酶学性质研究和结构鉴定,并对其基因进行体外扩增、序列和活性位点分析,主要研究内容和结果如下:1.通过单因素正交试验和响应面方法优化其产β-葡萄糖苷酶的发酵培养基成分和发酵条件。确定最佳培养基成分为:乳糖3%,氯化铵0.1%,MgSO4·7H2O0.1%;最佳发酵条件为:接种量为5%,转速160 r/min,装液量100 mL。在此最佳条件下,β-葡萄糖苷酶酶活力为1.953 U/mL,较初始酶活提高了144%。2.选用AKTA Purifier100全自动层析仪Sephadex G-200凝胶柱对β-葡萄糖苷酶粗酶液进行分离纯化,经SDS-PAGE电泳检测达到电泳纯,并研究了该酶的酶学性质。研究发现,该酶最适反应温度为80℃,最适pH值为6.16,耐酸碱稳定性好。金属离子中,Fe3+、Mg2+、K+对β-葡萄糖苷酶的活性起抑制作用,其中Fe3+对该酶的抑制作用最为明显,Fe2+、Mn2+对β-葡萄糖苷酶的活性起激活作用,其中Mn2+对β-葡萄糖苷酶的激活作用最为明显。有机溶剂中,甲醇、丙酮对该酶起到激活作用,其中甲醇的激活作用最明显,而乙酸乙酯对该酶具有明显的抑制作用。3.提取绿色木霉GIM3.139的基因组DNA,以其为模板利用PCR技术扩增得到大小为2 278 bp的bgl基因,并进行序列分析:该基因编码的β-葡萄糖苷酶分子量约为78.214 3 kDa,含744个氨基酸残基,最可能的剪切位点预测在第19位点和第20位点,且为分泌型蛋白;亲疏水性氨基酸分布均匀;该蛋白是以α螺旋5次跨膜;其二级结构为:无规则卷曲60.08%,β-折叠17.07%,α-螺旋22.85%;利用在线软件PDBsumGenerate和Swiss-Model Workspace,分析β-葡萄糖苷酶的活性位点,进行了三维结构的同源建模。4.利用5 800 MALDI-TOF/TOF质谱系统进行分离纯化后β-葡萄糖苷酶的分子量测定,测得β-葡萄糖苷酶的相对分子质量为57.628 17 KD。采用LC-MSMS分析,得出了其N端22个氨基酸的种类。采用LC-MSMS进行C端测序,未得到有效信息。利用圆二色谱测得β-葡萄糖苷酶的二级结构为无规则卷曲。