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由立枯丝核菌（Rhizoctonia solani Kühn AG-1 IA）引起的水稻纹枯病是世界上非常重要的水稻真菌病害之一,对水稻生产造成了严重的经济损失。立枯丝核菌主要以菌丝或菌核的形态存在于土壤中,菌核中黑色素的含量会影响其抗逆性,并且黑化的真菌能够表现出对寄主较强的毒力和抵抗多种不良环境。为了阐明水稻纹枯病菌黑色素形成的分子机制及其在致病过程中的作用,本论文围绕水稻纹枯病菌黑色素开展了一系列的研究与分析。现将主要研究结果报道如下:1.评估了4组化学物质,即化学肥料组（500μg/mL K2SO4、NaH2PO4、CO（NH2）2溶液）、金属离子组（5μg/mL CuSO4、FeSO4、ZnSO4溶液）、抗氧化剂组（5μg/mL槲皮素、桑色素、维生素C溶液）和对照组（300μg/mL莨菪碱、50μg/mL儿茶酚）对水稻纹枯病菌生长速率、菌核数量、菌核分布情况、菌核鲜重和干重以及黑色素含量等6个方面的影响以及它们之间的关系。研究结果表明:相同质量浓度不同药剂对水稻纹枯病菌的菌丝生长速率、菌核数量、菌核分布情况、菌核大小、菌核鲜重和干重以及黑色素含量的影响程度不同;黑色素形成的多少与菌丝生长速率以及菌核发育并无正相关关系,即抑制菌丝生长和菌核发育的化学物质,并不一定能够抑制黑色素的形成。对水稻纹枯病菌黑色素进行紫外可见光谱,傅里叶红外光谱和液相色谱-质谱分析,结果表明水稻纹枯病菌黑色素为儿茶酚黑色素。2.对水稻纹枯病菌菌丝体和发酵液的氨基酸成分进行了分析。结果发现水稻纹枯病菌菌丝体中天冬氨酸、谷氨酸和丙氨酸3种氨基酸含量相对比较丰富,其中谷氨酸的含量最高;水稻纹枯病菌发酵液中天冬氨酸和谷氨酸含量最为丰富,结果表明:不管是水稻纹枯病菌菌丝体还是发酵液都是谷氨酸和天冬氨酸最为丰富。影响水稻纹枯病菌菌丝体黑色素形成的前体物质酪氨酸的含量在三种处理的菌丝体比较中没有显著差异;但300μg/mL质量浓度的莨菪碱处理组与对照组和儿茶酚处理组中的苯丙氨酸含量都存在显著差异,而对照组和50μg/mL质量浓度的儿茶酚处理组的苯丙氨酸含量差异不显著。水稻纹枯病菌发酵液中对照组和50μg/mL质量浓度的儿茶酚处理组酪氨酸含量没有显著差异,但是300μg/mL质量浓度的莨菪碱处理组与对照组和儿茶酚处理组酪氨酸含量都存在显著差异,而苯丙氨酸在发酵液中差异不显著。3.测定了儿茶酚对水稻纹枯病菌生长速率,抗氧化酶如多酚氧化酶（PPO）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、谷胱甘肽S-转移酶（GSH-ST）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）和谷胱甘肽还原酶（GR）以及黑色素合成基因的RNA表达水平的影响。结果表明,在浓度为0至50μg/mL的儿茶酚诱导下,除了GSH-PX的酶活性在50μg/mL儿茶酚诱导下显著增加,PPO、POD、SOD、GSH-ST和GR的酶活性下降。水稻纹枯病菌在含有儿茶酚的PDA生长速率显著下降,但对水稻的致病力显著增强。荧光定量PCR（qRT-PCR）结果表明,4种黑色素生物合成基因,即蛋白酪氨酸磷酸酶基因（protein tyrosine phosphatase gene,Ptp）、分支酸变位酶基因（chorismate mutase gene,Cm）、过氧化物酶（peroxidase gene,Per）和苯酚羟化酶基因（phenol hydroxylase gene,Ph）在100μg/mL儿茶酚诱导下的表达显著下调。4.对苯酚2-单加氧酶基因（RsPhm）和过氧化氢酶基因（RsCat）在水稻纹枯病菌黑化中的功能进行了研究。结果表明:RsPhm基因的DNA和cDNA全长序列分别为2628 bp和1983 bp,开放阅读框（ORF）编码660个氨基酸。系统进化树分析显示,RsPhm基因在立枯丝核菌不同融合群中具有较近的亲缘关系,但在不同真菌之间在进化上具有一定保守性。外源儿茶酚能提高RsPhm基因的表达量。RsCat基因的DNA和cDNA全长序列分别为1814 bp和1395 bp,开放阅读框（ORF）编码464个氨基酸。保守结构域分析表明,RsCat蛋白具有过氧化氢酶超家族结构域和过氧化氢酶相关免疫反应结构域。系统进化树分析表明水稻纹枯病菌不同融合群的RsCat基因具有较高的序列同源性。荧光定量PCR（qRT-PCR）分析表明,RsCat基因的表达受儿茶酚的诱导,随着儿茶酚浓度增大,表达量上调,而CAT酶活随着儿茶酚浓度增大,酶活降低,说明RsCat基因的转录表达和CAT酶活不存在对应性。5.利用Illumina Hiseq2000测序系统对水稻纹枯病菌黑色素存在差异的样品进行了转录组分析。生物信息学分析结果表明,空白处理Rs=褐色、50μg/mL儿茶酚处理RsC=深褐色或黑色和300μg/mL莨菪碱处理RsH=白色样品的Reads都能准确比对到参考基因组上,说明RNA-Seq结果和参考基因组可靠。差异表达基因（DEGs）结果发现当Rs与RsC相比较时,有385个基因显著上调,而显著下调的基因则有208个;当Rs与RsH相比较时,显著上调的基因69个,而显著下调的基因有98个;而RsC与RsH相比较时,上调的基因有62个,而下调的基因则为50个。GO富集分析表明,DEGs描述基因的分子功能有14种、所处的细胞位置有16种和参与的生物过程有73种。KEGG分析水稻纹枯病菌黑色素合成基因主要分布于酪氨酸代谢通路和黑色素合成代谢通路。通过荧光定量PCR方法对12种差异基因的转录水平进行检测,qRT-PCR分析结果表明,12个差异基因的表达模式与RNA-Seq分析结果变化趋势一致。儿茶酚和莨菪碱都能够诱导活性氧的爆发,致病力显著增强。从转录组中筛选到8个黑色素合成相关基因（AG1IA00235、AG1IA09755、AG1IA01710、AG1IA05081、AG1IA06379、AG1IA09040、AG1IA02190、AG1IA01614）,对这些基因进行克隆测序和生物信息学分析,同时测定了它们在儿茶酚胁迫下的相对表达量,初步探索了它们在黑色素合成代谢通路起到的作用。6.采用RT-PCR技术,克隆了水稻纹枯病菌黑色素合成相关基因RsCao和RsPhs的cDNA全长序列。这两个基因大小分别为396 bp和828 bp,成功实现了RsCao和RsPhs基因在毕赤酵母（Pichia pastoris）中的表达,重组的毕赤酵母转化子可在含有1%的甲醇的BMMY培养基中高效分泌目的蛋白RsCao和RsPhs。通过观察重组的毕赤酵母转化子在不同儿茶酚浓度的酵母膏胨葡萄糖培养基（YPD）的黑色素形成,结果表明RsCao和RsPhs基因控制黑色素的效应不同,qRT-PCR也证明在不同儿茶酚浓度诱导下,水稻纹枯病菌的RsCao和RsPhs基因的表达量不同。以上研究结果明确了黑色素在水稻纹枯病菌致病过程中的作用,为水稻纹枯病的防治奠定了理论基础。