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本试验以山羊乳腺上皮细胞为研究对象,研究了四种长链脂肪酸(棕榈酸、硬脂酸、油酸和亚油酸)在山羊乳腺上皮细胞中的跨膜转运特征。试验一:选用乳汁分离法进行山羊乳腺上皮细胞分离培养,通过角蛋白-18荧光染色和β-酪蛋白基因表达的RT-PCR分析,对山羊乳腺上皮细胞进行鉴定。试验二:配制终浓度为60 μM 13C标记与未标记的长链脂肪酸混合液分别处理山羊乳腺上皮细胞0、1、2、4、6、12、24h,测定细胞δ13C值计算出山羊乳腺上皮细胞长链脂肪酸摄取最快的时间点。试验三:在试验二的基础上,分别配制终浓度为0,25,50,100,200,400,600,800 μM 13C标记与未标记的长链脂肪酸混合液处理细胞2 h,测定细胞δ13C值计算出山羊乳腺上皮细胞长链脂肪酸摄取的最佳浓度。试验四:在试验二和试验三的基础上选取处理时间2 h和终浓度50μM用于后续试验,研究不同抑制剂(β-环糊精、甲基-β-环糊精、二异硫氰酸二磺酸DIDS、硫基琥珀酰亚胺马来酰亚胺油酸酯SSO和根皮素)对山羊乳腺上皮细胞长链脂肪酸跨膜转运的影响。结果表明:1山羊乳腺上皮细胞原代分离及鉴定从乳汁中可以获得较少数量的乳腺上皮细胞供原代培养,该方法分离的细胞纯度高,获取细胞的周期较长但不易污染。角蛋白-18荧光染色显示细胞的红色荧光明显;细胞在诱导培养基中培养48 h后检测到β-酪蛋白的基因表达,证明所获得的细胞为正常生长且具有一定泌乳功能的山羊乳腺上皮细胞。2山羊乳腺上皮细胞对长链脂肪酸跨膜转运的时间依赖性研究山羊乳腺上皮细胞对棕榈酸、硬脂酸、油酸和亚油酸的摄取呈现时间依赖的饱和性,在处理2h时乳腺上皮细胞对棕榈酸、硬脂酸、油酸和亚油酸的摄取速率最快。因此,选择2h作为后续试验的时间点。3山羊乳腺上皮细胞对长链脂肪酸跨膜转运的浓度依赖性研究乳腺上皮细胞对棕榈酸、硬脂酸、油酸和亚油酸的摄取呈现浓度依赖的饱和性。棕榈酸吸收的米氏常数(Km)为88.72μM,最大吸收速度(Vmax)为75.19 μmol h-1 million cells-1;硬脂酸吸收的 Km 值为 61.61μM,Vmax 值为 12.00 μmol h-1 million cells-1;油酸吸收的 Km 值为 50.82μM,Vmax值为 20.58 μmol h-1 million cells-1;亚油酸吸收的 Km 值为 48.29μM,Vmax 值为 21.60μmol h-1 million cells-1。以上四种长链脂肪酸的平均Km值为62.36μM,在测试的浓度中,50μM浓度与平均Km值最接近,因此选择终浓度50μM用于后续试验。4不同膜蛋白抑制剂对山羊乳腺上皮细胞长链脂肪酸跨膜转运的影响试验结果显示,山羊乳腺上皮细胞对四种长链脂肪酸的摄取受到膜蛋白抑制剂的影响,不同抑制剂对山羊乳腺上皮细胞摄取长链脂肪酸的抑制效果存在差异。β-环糊精对油酸的最高抑制作用为31.2%(P<0.01),甲基-β-环糊精对硬脂酸的最高抑制作用为31.7%(P<0.01),而SSO对亚油酸有最高抑制作用为17.3%(P<0.01)。综上所述,乳汁分离法所获得的细胞为正常生长并具有一定生物学功能的山羊乳腺上皮细胞。山羊乳腺上皮细胞对长链脂肪酸的跨膜转运存在时间和浓度依赖性,其对长链脂肪酸吸收最佳的时间为2 h,终浓度为50μM。而膜蛋白抑制剂抑制细胞中长链脂肪酸跨膜转运的结果表明,蛋白介导方式在山羊乳腺上皮细胞中长链脂肪酸的跨膜转运具有重要作用。