论文部分内容阅读
解脲支原体是一种介于细菌与病毒之间的、能独立生活的最小原核细胞型微生物,同时也是一种易引起生殖道、泌尿道感染的病原微生物。对于男性会引起前列腺炎、尿道炎、肾盂肾炎等;对于女性会引起阴道炎、子宫颈炎、盆腔炎等生殖腔道的炎性反应,是造成不孕不育、流产的病原体之一。当前常用于检测解脲支原体的培养法和血清学方法灵敏度低、特异性差、假阳性高且耗时费力,然而,荧光定量PCR技术（FQ-PCR）因具有灵敏、快速、精确定量的优点,开始广泛应用在临床微生物检测方面。荧光定量PCR（FQ-PCR）检测技术融合了普通PCR高灵敏性、DNA杂交的高特异性和光谱技术的高精确定量等优点,能达到检测值更为精确、特异性更加灵敏、封闭式操作污染途径少的优点。它通过直接检测PCR反应过程中荧光信号的变化,以获取特定区段扩增产物定量的结果,不需要进行实验后处理或电泳检测,实现完全封闭操作,解决了普通PCR技术的诸多难题。目的:本研究建立及优化荧光定量PCR检测解脲支原体的反应体系,为临床微生物检测提供新的技术手段。方法:1.通过比对NCBI BLAST中已有的解脲脲原体和微小脲原体UreB基因序列,选择高度保守的区域设计引物和探针。2.利用以解脲脲原体Uu（serover 10,ATCC33699）、微小脲原体Up（serover3,ATCC700970）作为阳性对照,以临床分离株白色念珠菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、链球菌、粪肠球菌、加德纳菌、乳酸杆菌、人型支原体、人基因组DNA等9株菌株对照品作为阴性对照,以临床分离株Uu和Up作为阳性对照,以去离子水作为阴性对照,对反应体系中的Taq DNA聚合酶用量、Mg2+浓度、引物和探针的浓度优化后建立检测解脲支原体Uu和Up的FQ-PCR反应体系。3.将优化后的FQ-PCR应用于检测广医三院的临床门诊有尿道炎或宫颈炎的患者和健康体检者,分析荧光定量PCR法应用于临床的实用性。结果:1.在我们建立的定性FQ-PCR反应体系中,反应体系对9株对照品无交叉反应,无扩增曲线。临床分离株Uu和Up阳性对照组有明显的扩增曲线,说明Uu和Up荧光定量PCR反应体系对检测脲原体具有高度的特异性。同时,通过与9株其他菌群临床分离株对照品和临床分离株Uu和Up阳性对照组的检测,得到荧光定量PCR反应体系具有较高的精确性和灵敏性。2.369例尿道炎或宫颈炎患者中Uu单一阳性为55例,阳性率为14.91%,Up单一阳性为276例,阳性率为74.80%,Uu和Up混合感染32例,阳性率为8.67%,总检出率为98.37%。200例健康体检者中Uu单一阳性为10例,阳性率为5%,Up单一阳性为77例,阳性率为38.5%,Uu和Up混合感染2例,阳性率为1%,总检出率为44.5%。荧光定量PCR方法和测序法的检测结果总符合率为98.59%,一致性较好。结论:本研究在实验基础上建立了准确可靠的荧光定量PCR快速检测方法,该方法操作方便,检测周期短,灵敏度高,特异性好,同时克服了普通PCR技术假阳性率高的缺点,具有一定的临床应用价值。