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南蛇藤(CelastrusorbiculatusThunb.)为卫矛科南蛇藤（celastrus）属植物，分布广泛，其藤茎、根、叶、果均可入药。现代药物化学研究证实，其具有抗肿瘤、抗炎镇痛、抗菌、抗病毒、抗生育等广泛的药理活性。目前，国内外对南蛇藤抗癌活性及机理研究均有一定的报道。但对南蛇藤在抑制肿瘤生长及其诱导肿瘤细胞凋亡及途径等方面的研究并不深入，特别是在肝癌的研究方面。本课题以南蛇藤乙酸乙酯提取物为研究对象，分别应用体外细胞模型和体内动物模型对其抗肝癌的作用及机制进行了研究，从分子、细胞、蛋白、整个机体等不同层面和角度揭示南蛇藤的抑制肝癌的作用，为寻找筛选中药抗肿瘤药物、充分开发利用祖国中医药资源提供依据和理论基础。
[目的]：
通过对南蛇藤乙酸乙酯提取物在体外对肝癌细胞的增殖的影响、对肿瘤细胞凋亡的诱导以及在动物模型中抗肝癌作用的观察，从分子水平、细胞水平和整体水平等不同角度研究南蛇藤对肝癌的生长和转移的抑制作用，初步探讨其抗肝癌作用的机理，为研究开发南蛇藤抗肿瘤资源打下基础。
[方法]：
第一部分，南蛇藤对肝癌细胞HepG2的细胞毒性作用及其诱导细胞凋亡的实验研究
1．采用cck-8法检测不同浓度南蛇藤乙酸乙酯提取物对培养的人肝癌细胞HepG2增殖的影响。
2．通过双苯酰亚胺33342(Hoechst33342)/PI染色后，在荧光显微镜下观察经南蛇藤乙酸乙酯提取物诱导的HepG2细胞凋亡后细胞及细胞核的形态变化。
3．采用AnnexinV-FITC与碘化丙啶(promideiodine，PI)双染色法，通过流式细胞技术检测南蛇藤乙酸乙酯提取物干预HepG2细胞24小时后的人肝癌细胞HepG2的凋亡数量、细胞周期的影响。
4．采用琼脂糖凝胶电泳分析南蛇藤乙酸乙酯提取物作用于HepG2细胞后凋亡细胞DNA降解程度。
5．采用比色法试剂盒来检测南蛇藤乙酸乙酯提取物诱导HepG2细胞凋亡后对细胞内caspase3的活性。利用BSA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，计算单位浓度蛋白所具有的caspase3的活性。
6．通过流式细胞术检测南蛇藤乙酸乙酯提取物干预HepG2细胞后活性氧化物的含量。
7．应用免疫印迹法检测南蛇藤乙酸乙酯提取物干预HepG2细胞后相关凋亡蛋白的表达量。
第二部分，南蛇藤对肝癌原位荧光动物模型肿瘤生长和转移的抑制作用的研究
1．建立原位荧光蛋白表达的裸鼠肝癌移植瘤模型，采用活体荧光影像系统实时监测南蛇藤不同剂量组对动物在体肿瘤生长速度的影响，绘制肿瘤生长曲线，并监测治疗结束时移植瘤的重量。
2．采用活体荧光影像系统实时监测南蛇藤不同剂量组对移植瘤转移发生的影响，并分析评价南蛇藤提取物的药物毒性和安全性。
3．免疫组化法检测南蛇藤不同治疗剂量组肿瘤组织中VEGF的表达情况。
4．用RT-PCR法检测各实验组肿瘤组织提取的总RNA中VEGFmRNA的水平。
5.TENEL法检测各实验组肿瘤组织细胞凋亡比率。
6．免疫组化法检测各实验组肿瘤组织中caspase3的表达情况。
7．用RT-PCR法检测各实验组肿瘤组织提取的总RNA中caspase3mRNA的表达水平。
[结果]：
第一部分：
1．不同浓度的南蛇藤乙酸乙酯提取物（30、60、120、240、300μg/ml）对HepG2细胞均有一定的抑制作用，且随着药物浓度的增加，抑制作用逐渐增强，即对肿瘤细胞的抑制作用呈药物剂量依赖性。经统计学分析，各组差异有显著意义(P＜0.05)。
2．随着药物浓度的增加，HepG2细胞生长被抑制，细胞凋亡的数量增多。同时，随着作用时间的延长，细胞凋亡的数量增多，有时间依存性，而对照组细胞生长良好。
3.AnnexinV-PI检测数据也表明随着南蛇藤提取物浓度(15-120μg/ml)的提高，早期细胞凋亡的数量增加，在一定程度上存在量效关系。
4．药物干预24h后，HepG2细胞生长的细胞周期停滞在G0/G1期，以240μg/ml剂量组最为显著(P=0.01)：同时HepG2细胞生长过程中出现了亚二倍峰，说明细胞发生了凋亡。
5．随着南蛇藤提取物剂量的提高和作用时间的延长，DNA降解梯带表现越明显，亦表明药物引起的细胞凋亡与药物干预的剂量和作用时间存在依存性。
6.Caspase3活性检测表明，无论在24h干预组或48h干预组，随着南蛇藤提取物浓度（30、60、120μg/ml）增加，Caspase3活性逐渐增强，与剂量呈依存性。在南蛇藤120μg/ml组，caspase3的活性在药物作用24h时表现最强。
7．南蛇藤乙酸乙酯提取物作用HepG2细胞24小时后，细胞产生的ROS的量与药物的浓度呈一定的依存性，且具有统计学上的意义(P＜0.01）。另外，60μg/ml南蛇藤提取物作用细胞24h时，ROS的表达量呈现高峰浓度。
8．南蛇藤乙酸乙酯提取物干预HepG2细胞后，与阴性对照组比较，Cytochrome-c、pro-caspase9和caspase3的蛋白表达量增加；同时，随南蛇藤提取物浓度（30、60、120μg/ml）的增加，蛋白的表达亦增强。与阴性对照组比较，药物干预组Endo-nucleaseG的表达量也增加。
第二部分：
1．自RFP-Herp-G-2细胞接种第20天治疗组开始用药，第31天影像扫描提示各组移植瘤体积出现差异。至第45天，G1、G2、G3、G4、G5组移植瘤的体积分别为803.1mm3、83.8mm3、852.7mm3、410mm3、120.5mm3，G2、G3、G4、G5组移植瘤的体积分别为空白对照组的10.1％、106.2%、51.1%、15.0%；实验终止（第45天）时，G1、G2、G3、G4、G5组移植瘤重量分别为0.95g.0.36克、0.67g.0.48g、0.38g，G2、G3、G4、G5组移植瘤的重量分别为空白对照组的37.9%、70.5%、50.5%、40.0%。
2．大剂量南蛇藤治疗组、小剂量南蛇藤治疗组、南蛇藤预防治疗组与空白对照组在实验开始45天后，各组之间的肿瘤转移率没有明显的差异。奥沙利铂治疗组在治疗观察过程中未发现肿瘤转移。在开始治疗后，除奥沙利铂治疗组小鼠体重有所下降外，各组实验鼠体重均无明显下降。
3．免疫组化结果显示，VEGF主要在肝癌细胞的胞浆内表达，部分肝癌细胞膜也有少量表达，偶见细胞间质中表达。奥沙利铂治疗组的阳性表达率最低，大剂量南蛇藤治疗组、南蛇藤预防治疗组的阳性表达率显著低于小剂量南蛇藤治疗组与空白对照组(P＜0.05)。
4．各实验组肿瘤组织中的VEGFmRNA水平与免疫组化结果中VEGF的表达水平呈平行关系。奥沙利铂治疗组的VEGFmRNA水平最低，大剂量南蛇藤治疗组、南蛇藤预防治疗组的VEGFmRNA水平显著低于小剂量南蛇藤治疗组与空白对照组(P＜0.01)。
5．各实验组肿瘤组织的细胞凋亡的计数和凋亡率与各组肿瘤抑制程度相关，奥沙利铂治疗组、南蛇藤预防治疗组细胞计数和凋亡率较高，但二组之间比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。
6．免疫组化研究结果表明，caspase3主要表达于肝癌细胞的胞浆内，奥沙利铂治疗组的阳性表达率最高，大剂量南蛇藤治疗组、南蛇藤预防治疗组的阳性表达率显著高于小剂量南蛇藤治疗组与空白对照组(P＜0．05)。
7．肝移植瘤组织中caspase3mRNA水平与免疫组化中caspase3表达的情况相一致，奥沙利铂治疗组的caspase3mRNA水平最高，大剂量南蛇藤治疗组、南蛇藤预防治疗组的caspase3mRNA水平显著高于小剂量南蛇藤治疗组与空白对照组(P＜0.01)。
[结论]：
南蛇藤乙酸乙酯提取物具有较强的抑制肝癌生长作用，促进细胞凋亡和抑制血管生成可能是其抑制肿瘤生长的途径。本研究结果提示，南蛇藤对人肝癌具有潜在的治疗作用。