尖吻蝮蛇毒腺cDNA文库的ESTs分析以及一种新的类凝血酶基因的重组表达与活性研究

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以尖吻蝮蛇为研究对象,综合应用基因工程、蛋白纯化和生物信息学等功能基因组研究方法和技术手段,在构建尖吻蝮蛇毒腺cDNA文库的基础上,对其中一种类凝血酶新基因进行重组表达与功能研究,以期开发蛇毒的分子生物学资源,并为实现类凝血酶的重组表达提供实验证据支持.通过对尖吻蝮蛇毒腺cDNA文库的随机测序和分析,得到一个2009bp的编码尖吻蝮蛇类凝血酶的全长cDNA序列.它的读码框编码260个氨基酸的前体蛋白,包括18个氨基酸的信号肽、6个氨基酸的前肽和236个氨基酸的成熟蛋白.它的成熟肽分子量(不含糖基)为26kDa,含有12个半胱氨酸,形成6对二硫键.它含有与丝氨酸蛋白酶保守的催化三联体(H57、D102、S195)相一致的序列His67、Asp112、Ser206.氨基酸序列分析表明,该TLE氨基酸序列与几种哺乳动物的丝氨酸蛋白酶Kallikrein,trypsin,thrombin,chymotrypsin都只有20-30%的较低同源性,而具有与其它蛇毒类凝血酶的典型特点.为了获得有活性的重组表达类凝血酶,尝试了大肠杆菌、毕赤酵母和昆虫杆状病毒三种表达系统来对该类凝血酶进行重组表达,并且在毕赤酵母中获得成功.表达的蛋白分子量为28kDa,具有凝血活性,能特异性作用于纤维蛋白原的Aα链.该研究工作为类凝血酶的重组表达的深入研究提供了良好的基础.
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