髓样抑制细胞在胶原诱导的关节炎小鼠发病过程中的变化和作用研究

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目的:  类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种以关节滑膜炎症和软骨破坏为特征的慢性、全身性自身免疫性疾病。近年来研究发现髓样抑制细胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSC)在自身免疫性疾病的发病过程中发挥重要作用。本研究的目的是探讨MDSC在胶原诱导的关节炎(collagen-induced arthritis,CIA)小鼠发病过程中的动态变化及作用,从而为类风湿关节炎的治疗提供新的思路。  方法:  (1)使用牛Ⅱ型胶原和佐剂建立DBA/1J小鼠CIA模型并进行关节炎指数评分。免疫后第21天、28天、35天、40天和45天采用流式细胞术(flowcytometry,FCM)检测CIA小鼠及正常对照小鼠外周血、脾脏和骨髓CD11b+Gr-1+的MDSC比例动态变化。  (2)采用流式细胞术检测第35天CIA小鼠及正常对照小鼠脾脏MDSC表面CD40、CD80、CD86、MHCⅡ和PD-L1分子的比例。  (3)采用实时荧光定量PCR检测第35天CIA小鼠及正常对照小鼠脾脏MDSC精氨酸酶1(arginase1,ARG-1)、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)以及趋化因子受体CCR2、CCR5、CXCR2和CXCR4的mRNA相对表达量。  (4)流式分选第35天CIA小鼠脾脏MDSC,磁珠分选正常小鼠淋巴结CD4+T细胞,并且用羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester,CFSE)标记。MDSC与CFSE标记的CD4+T细胞以不同的比例(0∶1,1∶1,1∶2,1∶4,1∶8)共培养5天,加重组鼠IL-2和鼠T细胞活化CD3/CD28免疫磁珠刺激。采用流式细胞术检测CD4+T细胞增殖情况。  (5)流式分选第35天CIA小鼠脾脏MDSC,通过尾静脉注射过继转移给初次免疫后第14天的CIA小鼠,注射PBS作为对照。对小鼠进行关节炎指数评分。第45天处死小鼠,苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,H&E)染色分析小鼠关节组织病理变化,流式芯片检测小鼠血浆细胞因子的表达水平。  结果:  (1)免疫后的CIA小鼠大多在第28天开始出现足爪红肿,35天左右关节炎评分最高,然后缓慢降低。外周血CD11b+Gr-1+的MDSC比例在第35天、40天和45天高于正常对照小鼠(P<0.05)。CIA小鼠脾脏(P<0.05)和骨髓(P<0.01)中MDSC的比例在第21天、28天、35天、40天和45天均显著高于正常对照小鼠。  (2)第35天CIA小鼠脾脏MDSC表面CD80、CD86和PDl-L1的表达水平高于正常对照小鼠(P<0.05),但MDSC表面CD40和MHCⅡ的表达水平二者无统计学差异(P>0.05)。  (3)第35天CIA小鼠脾脏MDSC ARG-1和CCR2 mRNA的表达水平高于正常对照小鼠(P<0.05),CXCR2和CXCR4mRNA的相对表达水平低于正常对照小鼠(P<0.05),iNOS和CCR5的表达水平二者无统计学差异(P>0.05)。  (4)当MDSC/CD4+T细胞从1∶1到1∶4共培养时均能显著抑制CD4+T细胞增殖(P<0.05),当MDSC/CD4+T细胞为1∶1和1∶2时抑制作用最明显(P<0.001)。当MDSC/CD4+T细胞在1∶8共培养时,MDSC对CD4+T细胞增殖的抑制作用不明显(P>0.05)。  (5)过继转移MDSC与注射PBS的CIA小鼠相比,发病延迟,关节炎评分降低。关节组织病理学检查发现滑膜炎症、软骨破坏和骨质侵袭显著减轻。过继转移MDSC的小鼠血浆促炎性细胞因子TNF-α、IL-6、IL-17的表达水平与对照小鼠相比降低(P<0.05),抑制炎症的细胞因子IL-10的表达水平升高(P<0.05),IL-4和IFN-γ的表达水平二者无统计学意义(P>0.05)。  结论:  (1) CIA小鼠发病过程中MDSC的比例明显增高,并且呈现与发病情况类似的动态变化,提示MDSC可能在CIA小鼠病程进展中发挥重要作用。  (2) CIA小鼠发病高峰期MDSC表面分子和功能分子的表达出现改变,这些分子可能与MDSC的免疫抑制功能相关。  (3) CIA小鼠MDSC抑制CD4+T细胞增殖,过继转移MDSC又能改善CIA小鼠的病情,提示MDSC在调节自身免疫性关节炎的过程中发挥重要作用,为细胞生物治疗人类RA提供了新的思路。
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