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嗜热液化芽孢杆菌(Bacillus thermoliquefaciens-NL)产生的内切葡聚糖酶具有优良的热稳定性,工业应用潜力大.本研究克隆了嗜热液化芽孢杆菌内切葡聚糖酶基因,对基因进行定向进化,选用不同的表达系统对不同的重组酶基因进行表达.主要研究结果如下:
1、通过对不同来源的内切葡聚糖酶基因的同源序列比对,选择高度保守区域设计引物,克隆了嗜热液化芽孢杆菌内切葡聚糖酶基因Cel5A.测序表明,其长度为1,500 bp,编码499个氨基酸,N端起始的29个氨基酸为信号肽序列,其全长理论分子质量为55.2kDa.该基因和已报道的杆菌纤维素酶序列具有很高的同源性,如与Bacillus Subtilis. PAP115(Z29076)、B. subtilis.CK-2(X67044)的DNA序列同源性分别为99.8％、99.73％,所编码蛋白同源性分别达到99.6％、99.4％,已公布基因中的Glu490,Thr496分别被Arg和Ala所代替.
2、将内切葡聚糖酶基因全序列(Cel5A Ⅰ)和成熟肽序列(Cel5A Ⅱ)分别定向插入到原核表达载体pET-20b上,得到重组质粒pET-20b-Cel5A Ⅰ和pET-20b-Cel5A Ⅱ,均在大肠杆菌BL21 CodonPlus(DE3)-RIL中得以表达,单位发酵液的酶活力分别为0.0238U/ml和0.0242U/ml,SDS-PAGE分析表明Cel5A Ⅱ的表达量有所提高,但大部分表达蛋白为无活性的包涵体.
3、构建重组质粒pPICZαB-Cel5A Ⅱ并电转入毕赤酵母GS115获得基因工程菌GS115Cel5A Ⅱ,筛选得到的重组菌经甲醇诱导培养后,上清液的发酵活力最高为0.089U/ml,是大肠杆菌表达量的3.7倍.
4、根据其氨基酸序列以及毕赤酵母偏爱密码子,人工设计并通过重叠延伸PCR法合成内切葡聚糖酶成熟肽基因(Cel5AⅢ),长为1,427bp.构建重组质粒pPICZαB-Cel5AⅢ并电转入毕赤酵母GS115获得基因工程菌GS115 CelSAⅢ,诱导结果显示重组菌最高发酵活力为0.198U/ml,为GS115 Cel5A Ⅱ的2.2倍,表明选用酵母偏爱密码子可以提高Cel5A的表达量.