论文部分内容阅读
蕨类植物由于其特殊的分类地位，在物种起源、进化和分类方面极具科学价值；此外，大多数蕨类在医药、食用及园艺观赏等方面都有重要的经济价值。中国拥有丰富的蕨类资源，但是在开发利用方面却缺乏系统化的理论和技术支持。由于对自然环境的破坏和对野生蕨类资源的掠夺式开发导致很多蕨类濒临灭绝，也使得蕨类的产业化发展在中国受到重重阻碍。因此，对蕨类种质资源进行有效保护并建立一套繁殖技术体系显得尤为重要。利用孢子作为保存材料是保存蕨类种质资源的最佳途径，不仅能节省大量人力物力财力，而且操作方便，占用空间小，可以保存大量资源。而与之配套的繁殖技术的建立、发育过程的观察将不仅为检测保存方法的优劣提供依据，也将为蕨类种质资源从保存到有效利用搭建一座桥梁。
本研究以非绿色孢子(桫椤、大叶黑桫椤、黑桫椤和小黑桫椤)和绿色孢子(紫萁)为材料，在对孢子萌发进行调控并观察配子体发育过程的基础上，进行了孢子超低温保存研究，比较研究了不同保存方法的效果及研究影响孢子超低温保存效果的因素。实验结果如下：
(1)在调控培养基浓度、光照及温度的条件下完成了4种桫椤科植物(桫椤、大叶黑桫椤、黑桫椤和小黑桫椤)从孢子萌发到形成孢子体的过程，建立了孢子无菌培养技术体系。实验表明：4种桫椤科植物孢子在无机盐浓度低的培养基(1/5MS和1/10MS)上萌发较早且萌发率高，但配子体在较高无机盐浓度的培养基(1/2MS)生长更好。4种桫椤孢子在20-130μmol·m2·s-1光照条件下都能萌发，最适合的光照强度为30-40μmol·m2·s-1，随着光照强度的增强，孢子不仅开始萌发的时间延长，而且萌发率也明显降低，配子体生长缓慢。20-25℃是这4种孢子萌发的适宜温度，高于或低于这个温度，萌发都受到抑制甚至不能萌发。
(2)通过光学显微镜对孢子萌发类型、配子体发育类型进行详细的观察并记录萌发时间、萌发率及到达每个发育阶段所需的时间，通过扫描电镜对孢子表面显微结构进行观察。观察结果表明：桫椤孢子表面纹饰为条状，而大叶黑桫椤、黑桫椤、小黑桫椤孢子表面为刺状纹饰。4种孢子萌发方式均为桫椤型。桫椤配子体发育方式为铁线蕨型，而后3种孢子萌发方式则同时出现桫椤型或槲蕨型。紫萁孢子作为少数绿色孢子之一，其孢子中含有叶绿素，外壁较薄，萌发和生长都比非绿色孢子快很多，且能够自养，即在清水中也能有很高的萌发率。紫萁孢子萌发和配子体发育都为其独有的紫萁型。
(3)分别对非绿色孢子和绿色孢子进行超低温保存研究，实验表明：
通过将孢子保存于室温、4℃、-18℃和LN并比较保存效果发现：对桫椤、大叶黑桫椤2个种来说，常温、-18℃保存的孢子活力急剧下降；在短时间内(1个月)，4℃保存的孢子活力高于液氮，但经过长期保存，液氮能使孢子维持最高活力，保存1年后孢子萌发率分别为76.2％和68.4％(新鲜孢子活力为90.2％和87.6％)。此外，液氮保存后配子体发育过程出现畸形的比例大大降低，孢子细胞壁也保存得最为完整。对于黑桫椤这个种，常温、4℃和-18℃保存的孢子都在3个月内死亡，而在液氮中保存活力维持了1年。对紫萁来说，室温、-18℃保存1个月的孢子基本死亡。15d内，4℃保存的孢子活力高于液氮，但是长期保存于液氮能使孢子维持最高活力，保存1年后孢子萌发率为67.8％(新鲜孢子活力为87.2％)。说明液氮是长期保存非绿色孢子和绿色孢子的最佳方式。
通过比较不同干燥程度和成熟度的紫萁孢子在LN保存后的效果发现：干燥方法和成熟度均会影响紫萁孢子对干燥的耐受力和冻后存活力。相比于快速干燥(干燥器干燥)，慢速干燥(饱和盐法)能使孢子受到较小的伤害，而且所取得的结果比较稳定。此外，当孢子刚好成熟，即处于最佳生理状态时，孢子能够最大限度的忍受干燥和冰冻，取得最佳的保存效果。因此如何采集生理成熟的孢子是保存此类绿色孢子或其他短命孢子最关键的因素。